构树叶粗多糖对环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠免疫功能的影响

徐光沛 ，蒋 平，何燕飞，孙桃桃，陈存武,2，佘德勇，王敬利，左瑞华

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽六安 237012；2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室,安徽六安 237012； 3.安徽宝楮生态农业科技有限公司，安徽霍邱 237496)

近年来，中国畜牧经济发展飞速，养殖规模和养殖数量也在不断扩大，动物免疫抑制性疾病成为阻碍养殖业发展的主要因素。免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，对维持机体的健康极为关键。免疫功能失调时，机体更易受到侵害。因此，免疫调节对疾病的预防十分重要，能增强机体免疫力，提高机体对疾病的抵抗能力[1]，可以有效防御病菌和病毒的入侵[2]。环磷酰胺为临床上应用广泛的化疗药物之一，也是建立免疫抑制模型的常用药物。有研究表明，环磷酰胺具有骨髓抑制作用，长期使用会造成免疫细胞的生长发育受阻，也能对肝、肾等器官造成损伤[3]。多糖是由酮糖、醛糖通过脱水缩合成糖苷并链接在一起形成的一类天然高分子化合物，其种类多、结构复杂，广泛参与机体细胞的各种活动，是生命体三大基础物质之一。近年来，关于多糖的研究越来越多，许多文献均报道其具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、调节肠道菌群、免疫调节等功能[4-6]，有关多糖免疫调节作用被越来越多的学者关注，开发有效的多糖类免疫调节剂已成为研究热点。

构树，又名楮树，荨麻目桑科植物，主要分布在东亚地区，中国早在3 000 a前就有其相关记载。构树叶有清热解毒、凉血止血、利尿的功效，可用于崩漏、外伤等多种出血性疾病的治疗，外用可以治疗水肿、毒疮等[7]。构树叶不仅富含蛋白质、脂肪、氨基酸等营养物质，被国务院列为精准扶贫的十大工程之一。同时，构树叶还含有黄酮、多糖、挥发油等多种化学成分[8]，具有一定的药用价值。本研究利用环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型评价构树叶粗多糖对小鼠免疫功能的调节作用，以期为构树资源的进一步开发和利用提供 参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Mindry兽用全自动血液分析仪2600Vet(深圳迈瑞生物医疗电子有限公司)；东唐全自动生化分析仪DP180(广州东唐电子科技有限公司)；高速离心机TG16A(上海卢湘离心机仪器有限公司)；酶标仪BG-XM096(厦门百谷生物工程有限公司)；环磷酰胺(上海阿拉丁试剂有限公司)；血清总蛋白、白蛋白生化试剂盒(珠海森龙科技有限公司)；小鼠IgG和IgM酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(杭州联科生物科技有限公司)。

1.2 构树叶粗多糖的制备

采集新鲜的构树叶，55 ℃烘干，取200 g烘干的构树叶，加10倍体积的水，大火加热至沸腾后转为小火维持，煎煮1 h，过滤，收集滤液，滤渣加水继续煎煮1 h，再次过滤并收集滤液，合并两次收集的滤液，80 ℃旋转蒸发浓缩至200 mL左右，加4倍体积的95%乙醇，置于4 ℃冰箱过夜。次日，将过夜的溶液装入离心管，4 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀依次用石油醚、无水乙醇洗涤，重复3次。最后一次洗涤完后，弃上清，剩余沉淀置于60 ℃恒温箱烘至恒质量，得到构树叶多糖粉末(多糖含量13.1%)。

1.3 试验动物及处理

雌性ICR小鼠36只，清洁级动物房中适应性喂养7 d后随机分为6组，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组和构树叶粗多糖低、中、高剂量组，空白对照组不做任何处理；模型组按体质量2 mL/kg灌胃生理盐水，连续15 d，在第12天按50 mg/kg腹腔注射环磷酰胺，连续3 d；阳性对照组按2 mL/kg灌胃玉屏风口服液(1 g/mL)，连续15 d，在第1天按50 mg/kg腹腔注射环磷酰胺，连续3 d；低、中、高剂量组每天分别按50、100、200 mg/kg(以多糖含量计算)等体积灌胃构树叶粗多糖溶液，连续15 d，在第1天按50 mg/kg腹腔注射环磷酰胺，连续3 d。最后一次灌胃12 h后，称体质量，采集小鼠血液，检测各类白细胞数、血清蛋白及抗体水平；摘取脾脏，称质量，计算脾脏指数；采取空肠组织及脾脏组织置于4%的多聚甲醛溶液中充分固定，饲养期间自由采食饮水。

1.4 指标测定

构树叶粗多糖的测定：采用苯酚硫酸法测定多糖含量。

脾脏指数：脾脏指数=脾脏质量(g)/小鼠体质量(g)。

白细胞相关指标的检测：检测血液中白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的数量。

血清蛋白检测：将采集的血液离心取血清，利用生化分析仪检测血清总蛋白、白蛋白及球蛋白含量。

肠道组织和脾脏组织形态观察：取小鼠的空肠、脾脏，4%多聚甲醛固定，制作切片，HE染色观察[9]。

血清抗体水平的检测：将采集的血液离心取上层血清，严格按照ELISA试剂盒操作步骤，检测血清IgM和IgG抗体水平。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 21.0比较均值中的单因素进行分析，结果以“平均值±标准差”表示，比较各组之间的差异性，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 构树叶粗多糖对小鼠脾脏指数的影响

由图1可以看出，空白组的脾脏指数最高，同模型组相比，差异显著(P<0.05)，对照组、低剂量组和中剂量组的均高于模型组，但差异不显著(P>0.05)，高剂量组的最低。

“*”表示与模型组相比差异显著(P<0.05)，下同

2.2 构树叶粗多糖对免疫抑制小鼠白细胞相关指标的影响

如图2所示，与模型组相比，空白组白细胞数量最高，差异显著(P<0.05)，阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组白细胞数量均高于模型组(P>0.05)；观察各组淋巴细胞数量发现，与模型组相比，空白组淋巴细胞数最高(P>0.05)，阳性对照组的淋巴细胞数最低(P>0.05)；观察各组单核细胞数量发现，各组单核细胞数量均高于模型组，但与模型组差异均不显著(P>0.05)；观察各组中性粒细胞数量发现，阳性对照组的中性粒细胞数量最高，与模型组相比差异显著(P<0.05)。

图2 小鼠各类白细胞水平Fig.2 Levels of leukocytes in mice

2.3 构树叶粗多糖对免疫抑制小鼠血清蛋白的影响

如图3所示，模型组的总蛋白、白蛋白及球蛋白含量最低，同模型组相比，各组的总蛋白、白蛋白及球蛋白水平均有升高，其中空白组和低剂量组显著升高(P<0.05)。

图3 小鼠的血清蛋白水平Fig.3 Level of serum protein in mice

2.4 构树叶粗多糖对小鼠空肠组织形态的影响

由图4可以看出，模型组的肠绒毛结构不完整，部分肠绒毛出现断裂，绒毛长短不一。与模型组相比，空白组的空肠绒毛结构完整、排列整齐，肠绒毛之间的间隙较小；阳性对照组肠绒毛仅有少部分脱落、绒毛长短不一，肠绒毛之间间隙较小；低剂量组肠绒毛整齐排列且间隙较小，未见明显的脱落和断裂；高剂量组的肠绒毛间隙较大，仍有部分断裂及脱落。

图4 小鼠空肠组织的形态 (HE,×200)Fig.4 Histomorphology of jejunum in mice (HE, ×200)

2.5 构树叶粗多糖对小鼠脾组织形态的影响

由图5可以看出，空白组小鼠脾组织结构完整，红髓与白髓界限清晰，白髓区的淋巴小结内淋巴细胞排列紧密；模型组小鼠脾组织的红髓区和白髓区界限模糊，白髓区的淋巴小结排列松散；对照组和低剂量组小鼠脾组织结构完整，红髓区与白髓区界限较为清晰，高剂量组小鼠脾组织的红髓区和白髓区界限模糊，白髓区结构也不完整。

图5 小鼠脾组织的形态(HE,×200)Fig.5 Morphology of spleen in mice (HE, ×200)

2.6 构树叶粗多糖对小鼠血清抗体水平的影响

由图6可以看出，与模型组相比，空白组、阳性对照组、低剂量组和中剂量组小鼠的IgM、IgG水平均呈现升高，其中空白组、阳性对照组和低剂量组升高显著(P<0.05)，中剂量组IgG水平显著升高(P<0.05)，高剂量组小鼠IgM、IgG水平低于模型组。

图6 小鼠血清IgM和IgG水平Fig.6 Level of serum IgM and IgG in mice

3 讨 论

随着畜牧业的发展，养殖密度和养殖规模的不断提高，动物的免疫抑制性疾病成为养殖业健康发展面临的难题，一些细菌、病毒、药物、营养不良、疫苗接种失败等都会造成机体的免疫抑制[10]，给养殖业造成巨大的经济损失。因此，提高动物机体的免疫力，对免疫抑制疾病的防治具有重大的意义。环磷酰胺作为常用的免疫抑制剂已被广泛用于动物免疫抑制模型的构建，且效果十分明显。有研究表明，环磷酰胺能够抑制免疫器官发育、减少免疫细胞数量、降低抗体水平[11-12]。本研究结果显示，环磷酰胺显著降低小鼠的脾脏指数、各类白细胞数量、血清蛋白及抗体水平，同时对空肠黏膜及脾组织也造成不同程度的损伤，免疫抑制效果明显。

构树叶作为新型饲料资源，不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪酸和矿物质等营养物质，还含有多糖、黄酮、皂苷等化学活性成分[8]，已被国务院列为精准扶贫十大工程之一。研究证实，多糖作为中草药的主要活性成分之一，具有抗菌、抗氧化、调节肠道菌群、免疫调节等功能[4-5]，对受损的免疫器官也有一定的修复作用[13-14]。本研究发现，构树叶粗多糖能提升小鼠的脾脏指数，同时还能改善环磷酰胺造成的脾组织损伤，这与牛佳卉等[14]研究结果一致。脾脏是机体的重要免疫器官，是免疫细胞成熟及免疫应答的主要场所。脾脏指数和脾组织结构能直观反映脾脏的发育状况及免疫功能，通常情况下，脾脏指数升高是免疫增强的表现[16]。

白细胞主要包括淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞，其数量常作为临床判断机体抗病力的重要血液学指标[17]。研究表明，多糖能调节免疫细胞的生长和分化从而增强机体的免疫力[18]。本研究结果显示，构树叶粗多糖能增加白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞的数量，这与王莹等[19]研究结果一致。血清总蛋白是一类具有维持血液胶体渗透压、运输物质、解除毒性及免疫功能的蛋白，主要反映机体内蛋白吸收、代谢、营养水平[20]，包括白蛋白和球蛋白[21]，其中球蛋白与免疫功能密切相关[22]。有研究表明，多糖能够显著提高血清总蛋白含量[23]，这与本研究的结果一致。肠道是机体免疫系统的重要组成，主要通过小肠黏膜组织参与机体的消化吸收及免疫应答[24]。研究表明，多糖类物质能够通过调节肠道菌群、维持肠上皮细胞完整，提高肠道的免疫功能[25]。邓桦等[26]发现玉屏风多糖可通过增加肠壁厚度和绒毛长度，维持肠上皮细胞完整性，有效改善免疫抑制造成的小鼠肠黏膜损伤。本研究结果显示，构树叶粗多糖能维持小鼠空肠组织完整，增加肠绒毛长度，缩小肠绒毛间隙，这与Ying等[27]研究结果一致。免疫球蛋白是血液、组织液中具有免疫功能的一类重要物质。IgG是最主要的抗体，IgM是循环系统中最大且最早产生的抗体，具有发挥清除病原菌、激活补体、调节免疫功能等作用。研究表明，黄芪多糖[28]、羊栖菜多糖[29]等均能提高环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的血清IgG、IgM含量。本研究结果显示，低剂量的构树叶粗多糖及玉屏风颗粒能显著提高环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的血清IgG、IgM抗体水平，增强机体的体液免疫功能。

综上，构树叶粗多糖能通过提高脾脏系数、白细胞数量、血清蛋白和血清抗体水平，修复肠道及脾脏组织损伤，从而改善环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的免疫功能，以低剂量效果最好。