TOP2A在肺腺癌中的表达及相关免疫机制

徐健 杨琦 吴翠晖 段鸿露

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，已成为全球癌症相关性死亡的主要原因[1]。2018年，全球新增肺癌病例约210万，相关死亡病例约180万[2]。肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）是肺癌最常见类型，约占肺癌总病例的40%[3]。尽管早期诊断和治疗取得了显著进展，但5年相对总生存率低于20%[4]。免疫疗法被誉为LUAD的创新治疗策略。但有限的临床疗效、缺乏有效的预测生物标志物等因素限制了其更广泛的临床应用。有研究报道：肿瘤浸润淋巴细胞、中性粒细胞等与肿瘤免疫治疗的疗效和预后密切相关[5-6]。因此，明确肿瘤-免疫相互作用的免疫表型，寻找新的LUAD免疫治疗靶点非常迫切。拓扑异构酶2-α（topoisomeraseⅡalpha,TOP2A）是一种控制DNA拓扑变化、染色体分离、冷凝和染色体形成的酶。研究发现：TOP2A已成为阿霉素、依托泊苷等化疗药物的主要靶点[7-8]，但其抑制和杀伤细胞的确切机制尚不明确[9]。TOP2A在肾上腺皮质癌、鼻咽癌等多种癌组织中高表达，本研究利用多种生物信息学工具对TOP2A进行多角度分析，以期探明其在LUAD中的表达及其对肿瘤转移等作用的内在机制，为LUAD患者的预后生物标志物和新的潜在生物靶点候选提供参考。

1 材料和方法

1.1 Oncomine[10]数据库及检测指标 利用Oncomine数据库（http://www.oncomine.org）检测不同类型癌组织与正常组织中TOP2A表达差异。

1.2 GEPIA[11]数据库及检测指标 利用GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）检测TOP2A在LUAD中的表达水平。

1.3 GEO[12]数据库及检测指标 利用GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中 GSE31210数据集分析TOP2A在LUAD中的表达水平。

1.4 Ualcan[13]数据库及检测指标 利用Ualcan数据库（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）提供的基因表达和生存曲线的图表，分析LUAD不同临床病理特征中TOP2A表达差异。

1.5 Kaplan-Meier Plotter[14]数据库及检测指标 将患者样本中TOP2A按中位表达分为两组（高表达和低表达），利用Kaplan-Meier生存曲线（https://kmplot.com/analysis/index.php）评估TOP2A表达对LUAD预后的影响。

1.6 HPA[15]数据库及检测指标 利用HPA数据库（http://www.proteinatlas.org/）分析TOP2A在LUAD组织和正常组织中的蛋白表达差异。

1.7 cBioPortal[16]数据库及检测指标 利用cBioPortal数据库（http://www.cbioportal.org/）获取TOP2A突变信息及其对LUAD预后的影响。

1.8 TIMER[17]数据库及检测指标 利用TIMER数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析TOP2A在不同类型癌组织中的表达，分析LUAD中TOP2A表达与免疫细胞（B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞）浸润的相关性。

1.9 TISIDB[18]数据库及检测指标 利用TISIDB数据库（http://cis.hku.hk/TISIDB/）分析TOP2A的表达与趋化因子和免疫检查点调节剂基因表达的关系，以|r|作为确定TOP2A表达对免疫系统影响的标准，|r|为相关系数绝对值。|r|＞0.1认为TOP2A表达对免疫系统有影响；按照|r|大小排序，选取排序前6个基因。

1.10 统计学处理 Oncomine、GEPIA、GEO、Ualcan、HPA、cBioPortal、TIMER和TISIDB等数据库分析通过在线工具进行，P＜0.05为差异有统计学意义。利用Kaplan-Meier Plotter工具生成生存曲线，采用HR、95%CI和log-rankP值描述结果；采用Spearman秩相关分析评估基因表达与免疫细胞浸润水平、趋化因子和免疫检查点调节剂基因的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TOP2A在不同类型癌组织中的表达 Oncomine和TIMER数据库对TOP2A在不同癌组织及正常组织中表达的分析结果表明：相比正常组织，TOP2A在肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌等多种癌组织中高表达（均P＜0.05）。见图1。

图1 TOP2A在不同类型癌组织中的表达（a：Oncomine数据库；b：TIMER数据库）

2.2 不同数据库中TOP2A在LUAD中和正常组织中的表达差异 Oncomine数据库显示：有9个研究发现TOP2A在LUAD中表达上调。对各数据集的合并分析显示：TOP2A的表达中位数为30（P＜0.05）。Ualcan、GEPIA及GEO数据库显示：与正常组织相比，TOP2A在LUAD中显著过表达（均P＜0.05）。见图2。

图2 TOP2A在LUAD和正常组织中的表达（a：Oncomine数据库；b：Ualcan数据库；c：GEPIA数据库；d：GEO数据库）

2.3 TOP2A在不同临床病理特征LUAD中的表达差异 Ualcan数据库分析发现：与正常组相比，LUAD患者TOP2A在不同人种、性别、年龄、吸烟史等临床病理特征中的表达差异均有统计学意义（均P＜0.05）。具体表现为：男性LUAD患者TOP2A表达高于女性患者，吸烟LUAD患者高于非吸烟者或戒烟者，戒烟＞15年患者TOP2A高于戒烟＜15年者。对不同LUAD临床分期和淋巴结转移情况患者TOP2A表达差异的分析显示：与正常组相比，各临床分期和淋巴结转移组表达差异均有统计学意义（均P＜0.05），各临床分期之间TOP2A表达差异无统计学意义，但N3期TOP2A表达高于N0期及N1期，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 TOP2A在LUAD不同临床病理特征中的表达（a：不同年龄；b：不同性别；c：不同种族；d：不同吸烟习惯；e：不同分期；f：不同淋巴结转移情况）

2.4 TOP2A过表达对LUAD患者总生存的影响 TOP2A过表达与LUAD患者总生存率的下降显著相关（均P＜0.05），与不同性别患者生存率低显著相关（均P＜0.05），但与不同吸烟习惯人群生存率均无显著相关性（均P＞0.05）。见图4。

图4 TOP2A表达对LUAD生存率的影响（a：总生存率；b：男性患者生存率；c：女性患者生存率；d：吸烟患者生存率；e：不吸烟患者生存率）

2.5 TOP2A蛋白在LUAD中的表达 HPA数据库显示：和正常组织相比，LUAD中TOP2A蛋白表达明显升高。见图5。

图5 TOP2A蛋白在LUAD中的表达（a和b：正常肺组织；c和d：LUAD组织）

2.6 TOP2A在LUAD中的突变情况 TOP2A在LUAD患者中的基因突变率达2.6%；TOP2A突变组中，缝隙连接蛋白δ3（gap junction protein delta 3,GJD3）、胰岛素样生长因子结合蛋白4（insulin like growth factor binding protein 4,IGFBP4）、细胞分裂周期 6（cell divi-sion cycle 6,CDC6）、细胞周期蛋白依赖性激酶12（cyclin dependent kinase 12,CDK12）、铁硫簇结合结构域蛋白 3（CDGSH iron sulfur domain 3,CISD3）、DExD-box解旋酶 52（DExD-box helicase 52,DDX52）、延长蛋白BC和多梳抑制复合体2相关蛋白（elongin BC and polycomb repressive complex 2 associated protein,EPOP）、焦孔素A（gasdermin A,GSDMA）、IKAROS家族锌指蛋白3（IKAROS family zinc finger 3,IKZF3）、LIM和SH3蛋白1（LIM And SH3 protein 1,LASP1）等基因也存在突变。TOP2A基因突变能明显降低患者总生存率，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

图6 TOP2A基因在LUAD中的突变情况（a：TOP2A突变率；b：TOP2A共同突变基因；c：TOP2A突变对生存率的影响）

2.7 TOP2A表达与免疫细胞浸润的关系 TOP2A表达与 B细胞浸润呈负相关（r=-0.104，P＜0.05），与CD8+T细胞浸润和中性粒细胞浸润均呈正相关（r=0.110，0.165，均P＜0.05）。见图7。

图7 LUAD中TOP2A表达与免疫细胞浸润的相关性

2.8 TOP2A表达与趋化因子和免疫检查点调节剂基因的相关性 TOP2A与趋化因子7（C-C motif chemokine ligand 7,CCL7）、CCL26、C-X-C基序趋化因子配体10（C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10）等趋化因子正相关（均P＜0.05），与CCL14、CXCL16、CCL17等均呈负相关（均P＜0.05）。见图8（插页）。TOP2A显著相关免疫检查点调节剂包括免疫增强性和免疫抑制性。TOP2A与CD40配体（CD40 ligand,CD40LG）、IL-6受体（interleukin 6 receptor,IL-6R）、跨膜蛋白173（transmembrane protein 173,TMEM173）、肿瘤坏死因子受体超家族成员14（TNF receptor superfamily member 14,TNFRSF14）、TNFSF13等免疫增强剂基因呈负相关，与脊髓灰质炎病毒受体（poliovirus receptor,PVR）基因呈正相关。见图9（插页）。TOP2A与腺苷A2a受体（adenosine receptor A2a,ADORA2A）、B和T淋巴细胞相关蛋白（B-and T-lymphocyte-associated protein,BTLA）、半乳糖凝集素9（galectin 9,LGALS9）、转化生长因子 Beta 1（transforming growth factor Beta 1,TGFB1）等免疫抑制剂基因呈负相关，与表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274,CD274）分子、淋巴细胞激活物3（lymphocyteactivating 3,LAG3）等基因呈正相关。见图10（插页）。

图8 LUAD中TOP2A表达与趋化因子的相关性（a：CXCL10；b：CCL26；c：CCL7；d：CCL14；e：CXCL16；f：CCL17）

图9 LUAD中TOP2A与免疫刺激剂基因的相关性（a：TNFSF13；b：TMEM173；c：CD40LG；d：TNFRSF14；e：IL6R；f：PVR）

图10 LUAD中TOP2A与免疫抑制剂基因的相关性（a：LAG3；b：CD274；c：LGALS9；d：TGFB1；e：ADORA2A；f：BTLA）

3 讨论

TOP2A在转录过程中调控DNA的拓扑状态，参与染色体凝聚和染色单体的分离。在多种癌症中，TOP2A表达水平升高提示预后较差[7，19]。肺癌是致死率第一的恶性肿瘤，其存活时间很大程度上取决于诊断时的阶段。然而，40%～60%的肺癌患者直到晚期才被诊断出来[20]。因此很有必要寻找肺癌新的标志物，力争早期诊断，提高患者生存率。TOP2A表达和功能在LUAD中报道相对较少，其潜在作用机制仍不明确。

本研究通过查询Oncomine数据库发现：TOP2A在大部分癌组织中表达均增高，可能是共同的肿瘤标志物。对Ualcan、GEPIA、GEO等数据库的单个研究和Oncomine多个研究合并分析均证实：TOP2A在LUAD中表达高于正常对照组。可见TOP2A的表达具有较高的敏感度，有望成为LUAD新的生物标志物。Zeng等[19]研究发现：TOP2A与膀胱移行细胞癌临床病理特征相关。本研究通过Ualcan数据库查询发现：LUAD中的TOP2A表达水平与临床病理特征（如年龄、种族、性别、吸烟、疾病分期、淋巴结转移）密切相关。由此推断，TOP2A可作为LUAD病情评估的生物标志物。

本研究发现：相比低表达的LUAD患者，TOP2A高表达的患者总生存率下降；提示TOP2A高表达与总生存率降低相关，由此推测TOP2A可作为LUAD的预后标志物。与Kou等[21]认为TOP2A在LUAD中起重要作用、可作为预后指标和治疗靶点的观点一致。利用HPA数据库对TOP2A蛋白表达进行验证，结果显示：LUAD中TOP2A蛋白表达水平和基因一致。

基因突变在癌症的发生和进展中起着关键作用[22-23]。本研究发现：TOP2A在LUAD中存在基因突变，突变组LUAD生存率明显降低。TOP2A突变时伴有GJD3、IGFBP4、CDC6等基因共同突变，上述突变基因可能和突变的TOP2A共同促进LUAD发展。

机体免疫功能在肿瘤发生、发展中起重要作用，肿瘤的免疫治疗和临床结果依赖于免疫细胞浸润。对TOP2A与免疫细胞浸润的相关性分析发现：TOP2A的表达与免疫细胞浸润密切相关，这可能是TOP2A影响预后的机制。提示TOP2A可作为潜在的诊断和预后生物标志物，并可作为新的免疫相关治疗靶点。Chen等[24]认为TOP2A是LUAD预后的关键标志物，可能成为免疫治疗的靶点，与本研究观点一致。

趋化因子通过介导免疫细胞浸润，调节肿瘤免疫和肿瘤生物学表型[25]。本研究发现：TOP2A表达与CCL7、CCL14、CXCL16等趋化因子相关。血清CXCL16是判断非小细胞肺癌疗效的潜在生物标志物，通过调控NF-κB通路促进肺癌的生长和转移[26]。由此可推测TOP2A可能通过免疫反应影响LUAD的生物学行为，如免疫细胞的浸润和趋化因子的表达。

肿瘤微环境由包括免疫检查点在内的多种因素参与。免疫检查点表达异常可能导致肿瘤的发生、发展，促进肿瘤免疫逃逸。对TOP2A和不同免疫检查点调节剂基因关系的研究发现：不同种类的免疫检查点调节剂基因，如CD40LG、PVR、ADORA2A、CD274等与TOP2A表达相关，可能参与了TOP2A在LUAD中的生物过程，提示TOP2A可能通过调节免疫检查点来影响肿瘤生物学。

综上所述，TOP2A是LUAD重要的调节因子，可能在免疫细胞浸润中发挥重要作用，可作为预后的生物标志物，也可能是LUAD治疗的重要靶点。但由于在线数据库的局限性、数据库样本容量不同导致的结果偏差在所难免；同时研究是基于不同在线数据库分析而来，可能存在选择性偏倚。后续需要更深入的实验和临床试验来验证TOP2A在LUAD中的价值。