用于抗结核药物异烟肼检测的碳点/二氧化锰纳米探针的构建

王新旭，樊柄君，闫晓辉，王 宁

（1.山西医科大学 第一临床医学院，山西 太原 030001；2.山西医科大学 法医学院，山西 太原 030001；3.山西医科大学 基础医学院，山西 太原 030001）

肺结核是一种严重威胁人类健康的呼吸道传染病，每年全球范围内有数百万人口罹患结核病［1］。异烟肼（Isoniazid，INH）作为主要的抗结核药物之一，在现阶段肺结核的治疗中通常与其他药物联合使用。临床上，每个成年人每天服用INH 的最佳剂量约为4 ～6 mg/kg，不合理使用不仅会增加耐药性风险，还会导致肝毒性［1］、神经系统毒性［2］、过敏性皮疹［3］等副作用，甚至死亡。INH 含量的测定在药品质量控制或用药安全方面具有重要意义。

目前为止，已报道了各种测定INH的分析方法，包括滴定法［4］、紫外分光光度法［5］、流动注射化学发光法［6-7］、毛细管电泳［8］、电化学技术［9-10］、高效液相色谱（HPLC）［11-12］等。这些方法各有优势，但也有局限性，如传统的分光光度法、化学发光法和毛细管电泳法灵敏度不高；高效液相色谱法通常需要先进和复杂的仪器、大量的有机试剂和复杂的操作；电化学电极表面易受污染，影响测定的重复性和灵敏度。与上述方法相比，荧光光谱法具有选择性强、成本较低、操作简单、灵敏度高的优势，在检测领域引起了广泛关注，现已用于INH的定量检测。Zahra等［13］合成了壳聚糖纳米碳点作为荧光探针检测INH；Qin等［14］将叶酸热解合成碳点，以荧光法实现了生物样本中INH的检测。这些荧光探针检测异烟肼的检出限为µmol水平。为进一步降低检出限，提高灵敏度，构建一种能够简单、快速、灵敏检测INH的纳米荧光探针显得非常重要。

CDs是一种尺寸小于10 nm的新型碳纳米材料，具有较高的荧光量子产率、较强的抗光漂白性能和良好的生物相容性，近年来已成为生物成像［15］、生化分析［16］、微量分析［17］等领域的研究热点，在荧光检测领域也受到了广泛的关注［18］。MnO2纳米材料具有比表面积大、制备方便、紫外和可见光区吸收能力强等优点，优异的光吸收性能赋予其作为猝灭剂构建纳米荧光探针的潜能，在分析领域引起了极大关注［19-21］。基于MnO2纳米片对CDs荧光的良好猝灭效果，许多研究人员将这两种纳米材料结合用于检测，并在分子［22］、离子［23］和药物［24-25］分析领域展现出卓越的应用价值和广阔的发展前景。

本文使用微波法快速合成了CDs，通过在该CDs 溶液中加入MnO2纳米片构建了一种检测INH 的纳米荧光探针。采用透射电子显微镜（TEM）、X 射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X 射线衍射（XRD）、紫外可见吸收光谱（UV-Vis）和荧光光谱对材料的形貌和结构进行表征。MnO2纳米片可通过荧光共振能量转移（FRET）猝灭CDs 的荧光；但加入INH 之后，INH 与MnO2发生氧化还原，碳点的荧光得以恢复，据此可对INH 进行测定。该纳米探针不仅成本低、易于制备、绿色环保，且对INH具有高选择性和高灵敏度的优势，在生物样品INH的检测中具有广阔的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

4500型荧光分光光度计、U3900紫外可见分光光度计（日本日立公司）；JEM-1011透射电子显微镜（日本电子光学公司）；Paragon 1000型红外光谱仪（美国Perkin Elmer 公司）；微波炉（700 W，中国格兰仕微波生活电器有限公司）；FA1004N 电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；PHSJ3F 型实验室pH 计（上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂）；791 磁力加热搅拌器（北京科伟永兴仪器有限公司）；透析袋购自上海桥星贸易有限公司。

无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（分析纯，天津市北辰方正试剂厂）；磷酸（85%）、磷酸钠（分析纯）（南京化学试剂有限公司）；乙腈（天津市博迪化工股份有限公司）；异烟肼（INH）、柠檬酸、硫脲、奎宁、四甲基氢氧化铵（TMA·OH）、四水合氯化锰（MnCl2·4H2O）、N-乙基顺丁烯二酰亚胺（NEM）、葡萄糖、尿素、尿酸、甘氨酸、组氨酸、半胱氨酸、草酸、NaOH、H2O2、KNO3、CaCl2、NaCl均购自阿拉丁工业公司（中国上海）。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 CDs及MnO2纳米片的制备

CDs 的制备［26］：将柠檬酸（1 g）和硫脲（1 g）溶于去离子水（DI，20 mL）中，将该溶液在700 W 微波炉中加热5 min，得到深色的粘性固体。将固体产物加水溶解，离心10 min（8 000 r/min）去除沉淀。棕色上清液以15 000 r/min 离心10 min，得到的上清液再用去离子水以透析膜（1 000 Da）透析12 h，冷冻干燥得到固体粉末。

MnO2纳米片的制备［27］：将10 mL 四水合氯化锰（MnCl2·4H2O，0.3 mol/L）和20 mL 四甲基氢氧化铵（TMA·OH，0.6 mol/L，含3%（质量分数）的H2O2）混合，25 ℃搅拌反应12 h，10 000 r/min 离心15 min，收集沉淀。最后，将所得产物分别用超纯水和甲醇各洗涤3次，收集沉淀，50 ℃下干燥1 h。

1.3 荧光检测INH

将50 µL MnO2纳米片溶液（9.5 mg/mL）加入500 µL CDs 溶液（0.1 mg/mL）中，用PBS 缓冲液（pH 7.4）定容至20 mL，形成CDs/MnO2溶液。取10 µL INH 溶液于荧光比色皿中，用配制好的CDs/MnO2溶液定容至2 mL。室温下反应15 min 后，测定体系的荧光强度，在360 nm 激发波长下记录荧光发射光谱（激发和发射狭缝均为10 nm）。

1.4 荧光量子产率的测定

以硫酸奎宁为参比样品，分别记录CDs溶液和硫酸奎宁（QYs＝0.54，ηs＝1.33）的紫外可见吸光度值和荧光发射光谱，用公式QY＝QYs×（Iu/Is）×（As/Au）×（ηu/ηs）2计算CDs 的荧光量子产率。式中，QY为荧光量子产率；I为积分强度，A为吸光度；η为溶液的折光率，下标u 和s 分别代表CDs 和硫酸奎宁。通过计算得到CDs的荧光量子产率为22.34%。

1.5 实际样品的制备

尿样和血样的制备：人的尿样和血样由健康志愿者提供。首先将尿液以10 000 r/min 离心30 min，收集上清液，用超纯水稀释100 倍，置于4 ℃冰箱中备用。采血后立即取血浆，于3 000 r/min 离心5 min，保存于4 ℃冰箱。使用时向血浆中加入等体积乙腈，搅拌1 min 后，在4 000 r/min 下离心15 min，得到上清液，向上清液中加入NEM（150µmol/L）以阻断巯基物质的干扰。

片剂样品的制备：在研钵中将INH片剂充分研磨，将得到的粉末溶解于50 mL蒸馏水中，稀释100倍，用0.22µm微孔滤膜过滤，得到澄清溶液。

2 结果与讨论

2.1 CDs与MnO2纳米片的结构表征

用透射电子显微镜（TEM）对CDs和MnO2纳米片的形貌进行表征。如图1A所示，CDs颗粒形状接近球形，分散性良好，粒径分布在2.0～3.0 nm。HRTEM 图像（图1A 插图）显示，CDs晶格间距为0.21 nm。图1B显示，MnO2纳米片具有典型的二维片状形貌。X射线衍射（XRD）图谱（图1C）显示CDs在22.9°处有一个较宽衍射峰，表明CDs存在无序的碳结构；MnO2纳米片在12.1°、24.5°、36.6°和65.6°处有特征峰，与文献中α-MnO2纳米片的特征峰一致，说明制备的为α晶型的MnO2纳米片［28］。

此外，FT-IR光谱（图1D）表明CDs表面存在多种官能团。3 431 cm-1处的峰代表N—H/O—H的伸缩振动，表明CDs含有大量的氨基和羟基，这些基团赋予CDs良好的亲水性。3 600 ～3 100 cm-1处的宽吸收峰属于O—H和N—H的伸缩振动，位于3 182、1 663、1 415 cm-1处的峰分别属于C—H、C==C和C—N的伸缩振动，1 709 cm-1处的吸收峰代表—COOH中C==O的伸缩振动，2 060 cm-1处的吸收峰归属于C≡≡N的伸缩振动，2 366 cm-1和1 185 cm-1处的吸收峰分别代表S—H和C==S的伸缩振动。MnO2纳米片的FTIR图（图1D）在3 405、1 643、521 cm-1处的峰分别归属于O—H、C—O和Mn—O的伸缩振动。

图1 CDs（A）、MnO2纳米片（B）的TEM图谱及其XRD图谱（C）和FT-IR图（D）Fig.1 TEM images of CDs（A）and MnO2 nanosheets（B），and their XRD（C）and FT-IR（D）patterns the inset A shows the HRTEM image of CDs

CDs的X射线光电子能谱（XPS）如图2A所示，161.7、225.0、282.0、398.1、528.9 eV处出现的尖峰分别对应S2p、S2s、C1s、N1s和O1s，表明所得到的CDs主要由碳、氮、氧和硫元素组成。将CDs的XPS总谱分解得到C1s、N1s、O1s和S2p的精细图谱。C1s在284.5、285.6、287.8、288.8 eV处的吸收分别代表C==C、C—N/C—O、C==N/C==O 和O—C==O 基团。N1s谱在399.1、399.8 eV 处有两个峰，分别对应C—N—C 和N—C 键。O1s 的拟合谱图在531.6、533.7 eV 处有两个峰，分别归属于C==O 和C—OH/C—O—C键［28］。在S2p的拟合谱图中有4个峰，分别对应亚砜（164.9 eV）、—C==S—（163.9 eV）、—C—Sn—C（163.0 eV，n＝1或2）和—SH（163.5 eV）键。

图2 CDs（A）和MnO2纳米片（B）的XPS全谱图谱Fig.2 XPS spectra of CDs（A）and MnO2 nanosheets（B）

MnO2纳米片的XPS 如图2B 所示，在282.0、397.1、527.9、640.1 eV 处的4 个峰，分别对应C1s、N1s、O1s和Mn2p。将MnO2的XPS总谱进一步分解得到Mn2p和Mn3s的精细谱图。Mn2p在642.0 eV和653.9 eV 处有两个峰，分别为Mn2p3/2和Mn2p1/2的特征峰。此外，Mn3s 光谱的ΔE约为4.97 eV，表明MnO2纳米片主要以Mn（Ⅳ）价态存在［29］。这些结果表明MnO2纳米片成功合成。通过紫外可见吸收光谱（图3A 曲线a）进一步证实了MnO2纳米片的光学特性，其在360 nm 处有1个峰，在250 ～600 nm 处有较宽的吸收带；荧光图谱（图3A 曲线b、c）显示，CDs 的激发和发射与MnO2纳米片的吸收有很大的重叠区域。

图3 CDs的荧光激发和发射光谱及MnO2纳米片的紫外可见吸收光谱（A）与不同浓度的MnO2纳米片对CDs荧光强度的影响（B）Fig.3 Fluorescence excitation and emission spectra of CDs，UV-Vis absorption spectra of MnO2 nanosheets（A），and effect of different concentrations of MnO2 nanosheets on the fluorescence intensity of CDs（B）

2.2 CDs的稳定性

研究了CDs在不同pH值的PBS溶液、不同浓度的氯化钠溶液和紫外照射条件下于360 nm激发光下的荧光强度，发现CDs的荧光强度受环境影响较小，只在酸性较强的环境中荧光值降低，证明CDs具有良好的稳定性。

2.3 实验条件的优化

为获得INH 的最佳测定条件，分别对pH 值、反应时间和MnO2纳米片的浓度进行了优化。考察了不同pH 值（4.0 ～11.0）对CDs/MnO2-INH 体系荧光强度的影响，以IF0为CDs 的荧光强度，IF1为加入MnO2纳米片后的荧光强度，IF2为MnO2纳米片和INH 共同存在时CDs的荧光强度。在pH 4.0 ～7.4范围内，随着pH 值的增加，IF0/IF1与IF1/IF2的值均不断增大，并在pH 7.4 时达到最大值；随着pH 值继续增大，两比值均逐渐减小，即PBS缓冲液的pH值为7.4时INH的检测灵敏度最高。

在加入MnO2纳米片后CDs 的荧光强度迅速降低，1 min 后趋于稳定。在CDs/MnO2纳米片中加入20µmol/L的INH，荧光强度随孵育时间的延长而增加，15 min后达到稳定，故15 min为最佳反应时间。

为研究MnO2纳米片浓度对CDs 荧光的影响，将一系列浓度的MnO2纳米片与CDs 混合，并加入20µmol/L 的INH。结果显示CDs 的荧光强度随着MnO2纳米片浓度的增加而逐渐减弱，当MnO2纳米片的浓度为2 mmol/L时，猝灭效率达到99%左右（图3B）。而MnO2纳米片浓度为0.2 mmol/L时，INH对于CDs 荧光的恢复最灵敏，其浓度大于2 mmol/L 时不利于CDs 荧光的恢复。综合考虑，确定MnO2纳米片的最佳浓度为0.2 mmol/L。

2.4 方法检出限

加入INH 后，CDs/MnO2检测体系的荧光明显恢复。而无MnO2纳米片存在时，即使INH 浓度增至100 mmol/L，CDs 的荧光也不发生变化，表明INH 对CDs 的荧光没有影响。向CDs/MnO2检测体系中加入INH，溶液颜色由棕色变为无色，这是由于MnO2纳米片与INH 发生氧化还原反应分解为Mn2+，令MnO2溶液的棕色消失，CDs的荧光恢复。

考察了最佳条件下，不同浓度的INH对CDs/MnO2荧光光谱的影响。结果表明，CDs/MnO2纳米探针的荧光恢复效率与INH的浓度在0.5 ～60µmol/L范围内呈线性关系，其回归方程为y＝0.062 6x+1.098 8，相关系数r2＝0.998，其中x表示异烟肼的浓度（µmol/L），y表示IF/IF0（IF0和IF分别为加入INH前后CDs/MnO2的荧光强度）。以3σ/K计算检出限（LOD）（σ为空白样本的标准方差，K为线性方程的斜率），得到LOD为0.02µmol/L。与大多数已报道的INH测定方法（表1）相比，本方法具有较低的检出限。

表1 与其他检测方法的对比Table 1 Comparison with other detection methods

2.5 CDs/MnO2对INH检测的选择性及抗干扰能力

考察了常见糖类、生物大分子和金属离子对CDs/MnO2检测INH 的影响，结果如图4 所示。图中IF0 与IF 分别代表加入INH 前后CDs/MnO2的荧光强度。从图4A 可观察到只有INH 能显著恢复CDs/MnO2体系的荧光，其它常见糖类（Glu 和Fru）、生物大分子（Vc、Ace、UA、H2O2、Gly、His、Cys-NEM、GSH-NEM、OA、urea）和金属离子（K+、Ca2+、Na+或Zn2+）不会使CDs/MnO2+INH 体系的荧光强度发生明显恢复。探究了干扰物质存在下，INH 对CDs/MnO2体系的荧光恢复情况，结果如图4B 所示，当INH 浓度为50µmol/L，控制相对误差在±5%以内时，浓度为500µmol/L 的常见糖类、生物大分子和金属离子对CDs/MnO2检测INH无明显干扰。上述实验结果表明CDs/MnO2可特异性识别INH，常见糖类、生物大分子和金属离子在0 ～500µmol/L范围内对INH测定的干扰性较小。

图4 CDs/MnO2对INH的选择性检测（A）及常见糖类、生物大分子和金属离子对CDs/MnO2检测INH的干扰性（B）Fig.4 Selective detection of INH by CDs/MnO2（A），interference of common carbohydrates，biomacromolecules and metal ions on the detection of INH by CDs/MnO2（B）

2.6 实际样品测定

选取人尿样和血清样品作为研究对象，考察探针在实际样品中检测INH 的适用性和可靠性。向空白尿样和血清样品中加入INH 标准溶液，制成不同浓度（4、20、50µmol/L）的加标样品，进行加标回收实验，每个浓度重复测定3次，得到空白血样和尿样中INH 的回收率分别为94.8%～116%、99.0%～105%，相对标准偏差（RSD）均不超过5%（表2）。此外，将该方法用于市售片剂中INH 的检测，得到的INH 浓度与片剂的标示量非常接近，加标回收率为96.8%～102%，RSD 小于5%（表3），满足《中华人民共和国药典》（2020年版）［35］对同一片剂中INH含量的要求。

表2 血样和尿样中INH的检测Table 2 Detection of INH in blood and urine samples

（续表2）

表3 片剂中INH的检测Table 3 Detection of INH in tablets

2.7 机理研究

CDs 的荧光可被MnO2纳米片猝灭，由于CDs 的荧光发射光谱与MnO2纳米片的紫外吸收光谱重叠，初步推断猝灭机理为FRET或者内滤光效应（IFE）。FRET是一种通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移到受体的非辐射能量跃迁过程［33］。供体在能量发生转换后，荧光强度减弱，荧光寿命缩短；受体荧光被激发，荧光寿命增加；若受体无荧光特性，则表现为供体荧光被受体猝灭［34］。而IFE是指由于荧光体的激发光谱或者发射光谱与吸收体的吸收光谱重叠，导致荧光体发射强度降低的现象，但荧光体的荧光寿命不会发生变化［36］。MnO2纳米片在200 ～800 nm范围内有宽的吸收，与CDs的发射光谱有很大的重叠，供体CDs的荧光被受体MnO2猝灭；供体CDs的荧光寿命为2.6 ns，加入受体MnO2后其荧光寿命缩短为1.7 ns（图6）；而受体MnO2无荧光特性，表现为猝灭供体CDs的荧光。综上所述，CDs与MnO2相互作用的机理主要为FRET。其中荧光共振能量转移效率（E）可以由公式E= 1 -τa τ0（τa，τ0分别代表受体存在和不存在时供体的荧光寿命）获得［25］，经计算E为34.62%。

图5 反应机理示意图Fig.5 Schematic diagram of the reaction mechanism

图6 CDs和CDs/MnO2、CDs/MnO2+INH的时间分辨荧光衰减光谱Fig.6 Time-resolved fluorescence decay spectra of CDs and CDs/MnO2，CDs/MnO2+INH

3 结 论

MnO2纳米片与CDs之间存在的FRET效应可将CDs的荧光猝灭，而INH可将MnO2纳米片还原为Mn2+，从而使CDs的荧光恢复，基于此构建了一种简单快速地检测INH的纳米荧光探针。在优化条件下，CDs/MnO2纳米探针的荧光恢复效率与INH浓度在0.5 ～60µmol/L范围内呈线性关系，对INH的检出限为0.02µmol/L。CDs/MnO2纳米探针对INH有高选择性，常见糖类、生物大分子和金属离子对INH的检测基本无干扰。该探针已成功应用于血样、尿样以及片剂中INH的测定，检测结果准确可靠。CDs/MnO2纳米探针灵敏度高、选择性好、制备简单、成本低廉且对环境友好，在临床上能够帮助肺结核病患者合理控制药量，降低药物副作用。作为一种极具应用前景的纳米荧光探针，CDs/MnO2纳米探针在生物医学领域必将具有更广泛的用途。