基于大黄酸碳点荧光探针检测烟叶含水量的研究

沈劭怡，李 斌*，杨德志，杨亚玲

（1.云南省烟草烟叶公司 烟叶生产中心，云南 昆明 650214；2.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

含水量是烟草工艺技术的指标之一，对提升烟叶质量，烟叶后续醇化、预防霉变等均具有至关重要的作用［1］。在烟叶加工过程中，因为工序的不同，需反复调节烟叶含水率［2］，含水量对烟叶初烤、复烤等过程尤为重要。准确测定加工过程中烟叶的水分，对于烟草工艺具有重要意义［3］。现有的含水量测定技术主要包括费休氏法、重量分析法（包括常压干燥法、减压干燥法和热重分析法）、荧光探针法、气相色谱法和近红外光谱法等［4-5］。目前，对于烟叶加工过程中含水量的测定，普遍使用重量分析法即通过减压干燥法测定烟叶中的水分，并基于测定结果调节加工工艺［6］。然而，不同批次烟叶含水量存在较大差异，而现有方法存在检测用时长、检测过程繁琐、难于现场使用等缺点，导致烟叶加工过程中含水量测定存在较大困难［7-8］。荧光探针法具有检测灵敏、便携、简单、成本低等特点，在建立和开发新的含水量测定技术方面有一定优势。现有的含水量测定技术中，已有少量使用荧光探针的报道，如Kim 等［9］利用水分破坏染料和阴离子之间的氢键，导致负电荷大量离域，使得溶液颜色剧烈变化，从而实现了对有机溶剂中微量水分的荧光测定；Geng等［10］通过制备具有荧光信号的碳点，利用碳点与水分子之间的相互作用测定酒类产品中的水。因此，用荧光探针技术测定烟叶加工工艺过程中的含水量存在可行性。

碳点（Carbon dots，CDs）是一类尺寸小于10 nm 的碳纳米粒子，其表面缺陷使之具有发光特性［11］。根据合成原料和方法不同，可以在碳点表面修饰不同的官能团［12］对其荧光等特性进行调节。以碳点为荧光探针进行含水量测定，具有材料易获取、合成简单、检测快速等特点。

基于智能手机的比色法是近年来新兴的一种快速检测方法，因设备简单、操作灵活而备受关注［13］。利用智能手机拍摄记录与待测成分浓度相关的颜色，结合Adobe Photoshop、Image J 等软件，将颜色深浅数值化，根据RGB 值、灰度等的不同，用标准的已知浓度的溶液进行比色测定，可以实现目标物的定量分析［14-15］。该方法克服了目视比色法无法定量测定的缺点，且无需大型仪器，成本低，能够实现现场实时检测［16］。

本研究以大黄酸和硝酸镁为原料，通过微波法制备了大黄酸碳点（R-CDs）。基于水分子对碳点的荧光猝灭作用，建立了水含量测定的新方法，其示意图如图1 所示。结合智能手机信号采集技术，利用RGB 值比色法，建立了可定量检测烟叶加工过程中水含量的新方法。该方法具有很强的温度耐受性，可实现烟叶中水含量的快速分析。

图1 水含量测定示意图Fig.1 Schematic diagram of moisture content determination

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent G9800A 分子荧光光谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；TU1901 型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；TOP wave 型微波消解仪（德国耶拿分析仪器股份公司）；TENSOR27 型傅里叶红外光谱分析仪（德国Bmker 公司）；D8 型X 射线衍射仪（德国Bruker 公司）；Thermo Scientific Nexsa 型X 射线光电子能谱仪（美国ThermoFisher Scientific 公司）；Tecnai G2 场发射透射电子显微镜（荷兰FEI公司）。

复烤烟丝样品（云南省烟草烟叶公司烟叶生产中心提供）；大黄酸（上海麦克林生化科技有限公司）；硝酸镁、氢氧化钠、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、无水氯化钙、六水氯化铁（FeCl3·6H2O）、六水氯化镁（MgCl2·6H2O）、八水氢氧化钡（Ba（OH）2·8H2O）、氯化锌（天津市风船化学试剂科技有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇、四水氯化锰（MnCl2·4H2O）、氯化钠（天津市致远化学试剂有限公司）；盐酸（成都市科隆化学品有限公司）；六水氯化镍（NiCl2·6H2O）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化高汞（利样汞业化工有限公司）。其它试剂均为分析纯，实验用水均为去离子水。

1.2 大黄酸碳点（R-CDs）的制备

准确称取0.1 g 硝酸镁，加入20 mL 1 mmol/L 的大黄酸（DMSO 溶解）溶液中。溶解后置于微波消解仪中，于180 ℃消解30 min。取出后，室温自然冷却，得到淡黄色溶液，于10 000 r/min 离心15 min 后用0.22µm有机系滤膜过滤，即得大黄酸碳点，密封后于4 ℃保存。

1.3 水含量测定

取10µL 大黄酸碳点，用无水乙醇稀释至3 mL，作为荧光强度测定的工作液。在检测过程中，分别加入不同量的去离子水，并用无水乙醇定容至4 mL。涡旋混匀后，于525 nm激发光波长下，测定其在605 nm处的发射光强度。设定I0为大黄酸碳点自身的荧光强度，I为加水后大黄酸碳点的荧光强度。

1.4 烟叶加工过程水含量测定

先准确称取1.0 g烟丝样品，置于密闭干燥的20 mL 锥形瓶中，10 mL 注射器辅助抽真空10次，于90 ℃下加热10 min，将产生的气体导入碳点溶液中。反应结束后，补足挥发的乙醇，测定体系的荧光强度。

在相同条件下，取1.0 g 烟丝样品置于烘至恒重的称量皿中，于真空干燥箱加热至80 ℃，抽真空（压力为50～60 kPa），12 h后置于干燥器中冷却0.5 h，最后称至恒重。通过比较水含量与探针所测值的一致性考察方法的准确性。

1.5 RGB信号采集

RGB信号采集在如图1所示的避光盒子中进行，使用的智能手机为Xiaomi Civi（详细参数：6 400万像素主摄（f/1.79 光圈）+ 800 万像素超广角镜头（120°，f/2.22 光圈）+ 200 万像素微距镜头（f/2.4 光圈））。将“1.4”部分处理的样品置于避光盒子中，于365 nm 紫外灯照射下，保持手机的拍摄角度、拍摄参数一致，采用原相机模式、自动对焦、关闭闪光灯3 种方式对比色皿中的样品进行图像采集。采集图像信号后，利用Adobe photoshop CC 2019软件处理图片，并利用软件工具随机读取图像中3个点的RGB值，取其平均值。

2 结果与讨论

2.1 大黄酸碳点的表征

图2A 为大黄酸碳点的X 射线光电子能谱图（XPS），在166.7、284.6、399.6、532.4、1 303.8 eV处分别出现了S2p、C1s、N1s、O1s 和Mg1s 的特征峰，表明材料中存在S、C、N、O 和Mg 元素。其中元素相对含量依次为C ＞O ＞S ＞Mg ＞N（图2A插图），与大黄酸碳点制备原料中元素含量基本一致。

图2B为大黄酸碳点的红外谱图（FTIR），在3 450、3 220 cm-1处的特征峰分别归属于O—H、N—H的伸缩振动，其中N—H峰非常弱，表明N元素含量较低，该结果与XPS结果相一致［17］；1 625、1 134 cm-1处的特征峰分别对应于C===== O/C===== C、C—O 的伸缩振动［18］；1 375 cm-1处的峰属于C—S的拉伸振动，该结果进一步证明所制备的大黄酸碳点中存在S元素。

图2C 为大黄酸碳点的X 射线衍射谱图（XRD），27°处出现了明显的衍射峰，与石墨的（002）晶面相对应，说明碳点中包含类石墨烯结构［19］。图2D 为该碳点的透射电镜图（TEM），可以看出其粒径约2～4 nm，分散性较好。

图2 大黄酸碳点的XPS谱图（A）、FTIR谱图（B）、XRD谱图（C）和TEM图（D）Fig.2 XPS full spectrum（A），FTIR spectrum（B），XRD spectrum（C）and TEM image（D）of R-CDs

2.2 大黄酸碳点的光学性能

图3A 为大黄酸碳点的UV-Vis 和荧光光谱。可以看出，大黄酸碳点的荧光最大激发波长位于525 nm，最大发射波长位于605 nm。大黄酸碳点溶液在自然光下呈淡黄色，在365 nm 的紫外光照射下，则呈现明显的亮黄色荧光（图3A 插图）。在碳点的UV-Vis 谱图中，430 nm 处的特征峰归属于醌羰基的吸收谱带，大黄酸228 nm 和258 nm 位置处的特征峰消失［20］，表明碳点表面带有羰基基团。图3B 为大黄酸碳点在不同溶剂中的荧光强度，结果显示，使用去离子水稀释时碳点的荧光完全猝灭；而以乙醇作为溶剂时溶液为黄色。以DMF 和DMSO 作为溶剂时，在紫外灯下溶液颜色从淡黄色变为粉红色。以上结果表明，随着有机溶剂极性的增加，碳点605 nm 处发射峰的强度显著提升，碳点的最大发射波长出现红移。考虑到DMF 和DMSO 的毒性及其对发射峰的影响，后续研究中选择乙醇作为有机溶剂。

图3 大黄酸碳点的UV-Vis吸收光谱和荧光光谱（A）及其在不同溶剂中的荧光强度（B）Fig.3 Fluorescence and UV-Vis absorption spectra of R-CDs（A）and fluorescent intensity of R-CDs in different solvents（B）inset A：photograph of R-CDs solution without（left）or with（right）365 nm UV irradiation；inset B：photograph of R-CDs in water，ethanol，DMF and DMSO（from left to right）

2.3 实验条件的优化

考察了反应时间、反应温度、溶液pH值和不同金属离子对水含量测定的影响。结果表明，整个反应可在10 s内完成。乙醇在65 ℃温度范围内存在一定的挥发，但在补充乙醇溶液之后，体系荧光强度未发生明显变化，因此在65 ℃范围内，无需进一步考虑温度的影响。大黄酸碳点的荧光强度易受溶液pH 值的影响，仅在pH 值为中性时荧光强度最强（图4A），因此后续研究选择中性条件。此外，Fe3+、Cu2+、Co2+、Ni2+和Hg2+对大黄酸碳点的荧光强度有显著猝灭作用，Ba2+对碳点荧光有显著增敏作用（图4B）；说明金属离子对该荧光碳点的干扰较强。考虑到烟草加工过程中，水含量的测定过程较为简单，几乎不存在金属离子干扰，故该碳点依然可用于烟草加工过程中水含量的测定。

图4 溶液pH值（A）和不同金属离子（B）对大黄酸碳点荧光强度的影响Fig.4 The effects of solution pH value（A）and different metal ions（B）on the fluorescence intensity of R-CDs

2.4 荧光猝灭机制研究

考察了水的加入顺序对体系荧光的影响，发现先加入乙醇再加入水，体系荧光的猝灭程度更明显（图5A），因此在实验中先以乙醇稀释碳点溶液，再测定水分含量。体系的紫外吸收光谱（图5B）显示，随着水含量的增加，430 nm 处醌羟基的特征峰强度逐渐增加，540 nm 处配合物的特征峰逐渐降低。这是由于碳点制备过程中，大黄酸分子结构中的羰基、羟基等会与Mg2+形成配合物，从而在540 nm 位置处出现配合物的特征峰，而作为质子性溶剂的水加入后，可有效促进Mg2+从羰基或羟基上解离下来，从而导致羟基峰强度逐渐增加，配合物特征峰强度逐渐降低；同时，Mg2+的解离还会导致碳点的聚集，降低电子离域程度，使体系荧光强度降低［21］。

图5 水加入顺序对碳点荧光的影响（A）及不同水含量对碳点最大紫外吸收的影响（B）Fig.5 The effect of water addition order on the fluorescence of R-CDs（A）and the effect of different water contents on the maximum UV absorption of R-CDs（B）

另一方面，碳点的最大发射波长随有机溶剂极性的增加存在明显的红移现象（图3B），说明所制备的碳点具有溶剂依赖性，而水作为极性溶剂也会导致发射波光红移［22］。Senthamizhan 等［23］发现，当以DMSO（非质子传递溶剂）作为溶剂时，加入质子传递溶剂（即水）会促使非辐射弛豫途径，如与周围分子的振动耦合、分子内旋等增强，造成碳点聚集，荧光强度降低。这与本实验中以DMSO 作为溶剂，利用大黄酸碳点荧光测定水的结论相一致。

2.5 线性关系及检出限

在水含量为30～1 000 mg 时，碳点荧光的猝灭程度与水加入量之间呈良好的线性关系，线性方程为y=-0.274x+393.858 7（r2=0.994 1），其中x和y分别为水加入量和大黄酸碳点的荧光强度。根据3δ/S（δ为空白样品的标准偏差，S为线性校准曲线的斜率）计算得到检出限为5 mg。

2.6 水含量的RGB比色法测定

将拍摄的不同水含量下大黄酸碳点的荧光照片使用软件Adobe photoshop CC 2019 进行处理，截去无关背景，获取RGB 值。每张图随机取3个点，并取其平均值作为最后的RGB 值进行数据处理。分别读取R值、G值和B值，并以水含量为横坐标x，R值、G值或B值分别为纵坐标y绘制标准曲线，筛选最优标准曲线。结果表明，以R 值作为纵坐标时，所拟合的方程最优：y=-0.115 38x+215.426 88（r2=0.990 2）。

2.7 实际应用

研究分别采用上述荧光和RGB 比色方法，测定加工过程中相同批次烟叶的水含量，并与减压干燥法相对比，测定结果如表1 所示。荧光和RGB 比色方法与减压干燥法测定值之间的相对误差均小于4.0%，说明本方法的测定结果与减压干燥法基本一致。而与减压干燥法相比，RGB 比色法操作时间更短，且可实现样品中水分的现场测定，无需大型仪器设备，成本低。

表1 实际样品测定结果（n=3）Table 1 Results of the actual samples（n=3）

3 结 论

本研究利用水对大黄酸碳点的荧光猝灭作用，结合智能手机RGB 信号采集技术，建立了一种可用于烟叶加工过程中水含量测定的新技术。在最优条件下，H2O 检测的线性范围为30～1 000 mg，检出限为5 mg。结合智能手机采集样品的图像信号，并根据R 值比色方法建立的水含量检测技术，可以实现烟叶中水含量的现场快速测定，无需使用大型设备，成本低。本研究为水含量检测提供了新的策略，同时也为水含量测定试纸的设计打开了新的研究思路。