基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱的结直肠癌患者血清脂质组学研究

陈鸿炜，农艳瑛，朱一帆，梁运啸，周海琳，张嘉豪，张淇淞*

（1.广西大学 医学院，广西 南宁 530004；2.广西中医药大学附属瑞康医院 消化内科，广西 南宁 530011；3.广西壮族自治区人民医院 消化内科，广西 南宁 530021）

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）又称大肠癌，是消化系统最为常见的恶性肿瘤。癌症是世界各国的主要死亡原因，而CRC 在世界癌症的致死率为9.4%，是癌症死亡的主要原因［1］。CRC 的早期发现对于患者的治疗和愈后有着很大影响，CRC早期患者5年以上生存率达98%，而终末期患者5年以上的生存率则不足10%［2］，且早期患者的预后良好。因此，CRC 的早期诊断和发现可有效降低死亡率和提高生存率。然而，由于CRC 早期缺乏典型临床表征且诊断困难，大多数患者发现时已为癌症中晚期。目前，CRC 的常规诊断方法分为侵入性和非侵入性两种。前者包括柔性乙状结肠镜和结肠镜检查，后者包括粪便、血液检查以及放射学检查［3］。现有的非侵入性检查诊断虽较为简便，且患者依从性好，但敏感性和特异性较低；侵入性的肠镜检查为结直肠癌诊断的金标准，准确度高，但患者耐受性差，并发穿孔和出血等风险，且检查费用和技术要求高，大规模应用难以实现［4］。因此，急需寻找一种诊断性能高、微创且便捷的标志物用于CRC诊断。

脂质是一类分布广泛的内源性代谢物，具有许多重要的生理功能。脂质代谢途径的改变在许多常见疾病的预测、预后和诊断中发挥关键作用，其在疾病发病机制中的潜在作用在许多人类疾病中得到广泛研究［5］。脂类物质也被证实参与多种癌症的发生与恶化［6-7］。近年来，研究证实CRC与脂质代谢异常存在密切关系［8-9］。脂质组学是研究生物体内脂质代谢的一种有效技术，同时在肿瘤标志物的探索中表现出巨大潜力，近期已成为研究热点［10］。通过CRC 组织脂质组学研究发现，溶血肝磷脂酰胆碱（LPCs）和磷脂酰胆碱（PCs）是与CRC 产生和恶化最密切相关的生物标志物［11-12］。然而，目前尚无采用血清脂质组学探索CRC生物标志物的研究报道。

超高效液相色谱串联高分辨质谱（UHPLC-HRMS）以其高通量、高选择性和高灵敏度的优点成为脂质组学中最常用的分析技术。本文利用高灵敏度和高分辨率的超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q Exactive-Orbitrap MS）进行CRC患者的血清非靶向脂质组学研究，通过对比发现健康人和CRC 患者的脂质代谢轮廓差异，结合多元统计分析对其进行筛选和评价，进而获得具有良好诊断效能的肿瘤标志物，为CRC的临床诊断提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UltiMate 3000超高效液相色谱仪-四极杆-静电场轨道阱质谱（美国赛默飞世尔科技公司）；高速冷冻离心机（德国艾本德公司）；密理博超纯水系统（美国密理博公司）；涡旋器（上海精科仪器有限公司）；超声仪（上海生析超声仪器有限公司）；制冰机（意大利Scotsman公司）。

棕榈酰乙醇胺、棕榈酸、鞘氨醇标准品购于美国Sigma-Aldrich 公司。甲醇、二氯甲烷、异丙醇、乙腈、甲酸铵、甲酸（色谱纯，美国默克公司）；超纯水（美国密理博公司）。

1.2 样本来源及处理

CRC患者和健康人（NR）血清样品均采集于广西壮族自治区人民医院，且研究方案经广西壮族自治区人民医院伦理委员会批准（伦理号：KY-DZX-202008），所有受试者均签署知情同意书。根据以下标准纳入CRC 患者（n=50）：（1）病理诊断为结直肠癌；（2）术前未接受手术、化疗、放疗；（3）无严重代谢性、血液病或恶性肿瘤。健康受试者（n=50）为经结肠镜检查证实无任何肠道肿瘤且无严重代谢性、血液病或恶性肿瘤的健康人群。术前受试者禁食8 h后，通过促凝采血管采集全血样本，在室温下静置1 h后，以5 000 r/min在4 ℃下离心10 min，分离上层血清转移至新的EP管中，80 ℃下冷冻储存备用。

血清样品制备：将超低温储存的血清置于冰上解冻，吸取50µL血清，加入500µL预冷却的二氯甲烷-甲醇溶液（3∶1，体积比），涡旋5 min 后置于冰浴下10 min，以13 000 r/min 在4 ℃下离心10 min，离心管中的溶液分成3 层。取中层的二氯甲烷溶液300µL，在真空下干燥。干燥样品用600µL 乙腈-异丙醇溶液（1∶1，体积比）复溶，涡旋2 min 后，于冰浴条件下超声5 min。涡旋1 min 后将混合物在4 ℃下以13 000 r/min离心15 min，取上清液用于血清脂质分析。在正式进样前，精密吸取已制备的各待测血清样品5µL混合，作为质量控制样品（QC），用于评价分析系统和方法的稳定性及重现性。

1.3 色谱与质谱条件

色谱条件：Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8µm）；流速为0.3 mL/min；流动相：A 为体积比60∶40 的乙腈-水溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L 甲酸铵），B 相为体积比90∶10的异丙醇-乙腈溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L 甲酸铵）。梯度洗脱程序为：0.0～4.0 min，70%～40%A；4.0～9.0 min，40%～0%A；9.0～15 min，0%A；15～18 min，0%～70%A；柱温为40 ℃；进样量为5µL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI 源），辅助气流速为13 arb，鞘气流速为40µL/min，毛细管温度为320 ℃，雾化气温度为420 ℃，喷雾电压为3.50 kV（正离子）或2.80 kV（负离子）；数据采集模式为Full Scan+ddMS2；阶梯式碰撞能量（10、20、40 eV）；一级扫描范围为m/z100～1 200，一级和二级质谱的分辨率分别为70 000和17 500。

1.4 质谱数据处理及分析

（1）将2 组样品的原始数据文件导入代谢组数据处理软件Compound Discovery 3.1（Thermo Scientific，Fremont，CA，USA）中，提取脂质组学数据（包括离子特征、保留时间、质荷比和峰强度），并应用QC数据进行峰对齐和归一化处理。（2）根据数据的正态分布情况，采用Mann-WhitneyU检验或Student’t检验进行脂质特征的组间差异分析，P＜0.05则认为该特征组间差异具有统计学意义。（3）将已提取数据文件导入Simca-P 14.0 软件中进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），并通过200 次置换检验进一步考察OPLS-DA 模型的可靠性和适用性，避免数据分析的过度拟合。结合倍数变化小于0.67或大于1.5且P＜0.05为标准筛选差异脂质特征。（4）根据精确分子量和保留时间误差（10 ppm 和0.2 min），以及自带数据库mzCloud 和LipidBlast 鉴定脂质标志物。（5）采用MetaboAnalyst 5.0软件对组间差异脂质进行受试者工作特征曲线（ROC）分析，以探索CRC的诊断脂质标志物。

1.5 研究对象的基线特征

本研究的受试者共有100名，NR和CRC临床血清样本各50例。基本的临床信息如表1所示，两组间的性别和年龄构成无统计学差异。CRC 患者病变部位以结肠和直肠进行分类，其分化程度和肿瘤分期用于评估CRC的严重程度。

表1 受试者的基本临床信息Table 1 Basic clinical informations of subjects

2 结果与讨论

2.1 主成分分析

通过建立PCA 模型进行分析，考察仪器系统和检测方法的稳定性及样本的分布趋势。由PCA 三维得分图（图1A、1B）可知，QC 样本在2 种ESI模式下均紧密聚集，表明其脂质组学特征未发生漂移，说明分析系统在批量分析过程中具有良好的稳定性和重现性，满足脂质组学分析的要求。NR 组和CRC组分别位于得分图两侧，组间区分较为明显，说明两组的血清脂质谱存在差异。同时，大多数样本在95%的置信区间内，少数超出95%置信区间的样本呈现较为离散趋势，可能由于存在较大的个体差异。提取QC 组中各脂质特征的峰面积，发现大多数脂质特征峰面积的相对标准偏差（RSD）小于20%，表明整个测试过程中分析系统的稳定性良好。

2.2 正交偏最小二乘判别分析

为了更清楚地辨别出NR 与CRC 组间的血清脂质谱差异，在PCA 分析的基础上基于所有检测到的脂质特征构建OPLS-DA 模型进行分析，以筛选生物标志物。相对于PCA 分析，由OPLS-DA 分析的三维得分图（图1C、1D）可以看出NR 组和CRC 组的组间区分更明显，表明两者血清脂质谱差异显著。正离子模式下OPLS-DA 模型的R2X、R2Y、Q2 值分别为0.488、0.980、0.947；负离子模式下分别为0.549、0.923、0.770，表明所建立的模型对数据描述和预测能力良好。采用200次置换检验进一步考察了OPLS-DA 模型的可靠性，正离子模式下置换检验主要参数R2、Q2、P值分别为0.784、-0.361 和0.000（图1E），负离子模式下3 个参数值分别为0.685、-0.358 和0.000（图1F），且直线初始点均高于样品点，提示该分析模型不存在过拟合，应用合理。

图1 健康对照组（NR）和结直肠癌组（CRC）血清脂质组学的PCA三维得分图（A、B）、OPLS-DA三维得分图（C、D）以及OPLS-DA模型的置换检验图（E、F）Fig.1 PCA 3D score plots（A，B），OPLS-DA 3D score plots（C，D）and permutations test for the OPLS-DA model（E，F）of serum lipids in normal control group（NR）and colorectal cancer group（CRC）A，C and E：in ESI+mode；B，D and F：in ESI- mode

2.3 生物标志物的筛选与诊断效能评价

根据两组间的变化倍数和差异分析统计值，以倍数变化＞1.5或＜0.67，且P＜0.05为标准筛选组间差异脂质，共发现155 种差异脂质（ESI+、ESI-模式下分别有18 种和137 种）。其中，DAG、TAG、PC、LPC、LPE、SM、PE、PI、Cer、FA 的数量构成比例分别为1.94%、27.10%、30.32%、9.03%、1.29%、9.68%、3.87%、2.58%、7.74%、6.45%（图2）。PC 和TAG 的总构成比高达57.42%，表明PC 和TAG 的代谢紊乱可能与CRC 的癌变机制有关。另外，相对于NR组，大多数差异脂质在CRC组血清中表达均呈显著下调，只有9个差异脂质在CRC组血清中表达呈显著上调。

图2 不同类别差异脂质的构成分布Fig.2 Component distribution of differential lipids DAG：diacylglycerol（甘油二酯）；TAG：triacylglycerol（甘油三酯）；PC：phosphatidylcholine（磷脂酰胆碱）；LPC：lysophosphatidylcholine（溶血磷脂酰胆碱）；LPE：lysophosphatidylethanolamine（溶血磷脂酰乙醇胺）；SM：sphingomyelin（鞘磷脂）；PE：phosphatidylethanolamine（磷脂酰乙醇胺）；PI：phosphatidylinositol（磷脂酰肌醇）；Cer：ceramide（神经酰胺）；FA：fatty acid（脂肪酸）

基于以上筛选的差异脂质，采用受试者工作特征曲线（ROC）的曲线下面积（AUC）值评估其对CRC 的诊断能力，根据AUC ＞0.80 筛选CRC 潜在诊断脂质标志物。在ROC 分析中，发现9 个潜在脂质生物标志物具有良好的CRC 诊断能力（AUC ＞0.80），包括棕榈酰乙醇胺、棕榈酸、鞘氨醇、SM d40∶3、SM d36∶0、TAG 58∶1、PC 34∶2、PC 36∶6 和PC 38∶7，其AUC 值分别为1.00、0.86、0.81、0.85、0.81、0.89、0.81、0.87 和0.83。其中，棕榈酰乙醇胺具有最高的AUC 值（为1.00），表明其对CRC的诊断效能突出，而SM d36∶0、PC34∶2和鞘氨醇的AUC 值则相对较低，均为0.81。mzCloud 和LipidBlast 脂质数据库匹配的鉴定结果如图3 所示，鉴定效果良好。总体上，上述9 种差异脂质对CRC 均呈现良好的诊断效能，可作为CRC的候选诊断标志物。

图3 9种高诊断效能差异脂质的鉴定过程Fig.3 Identification of 9 differential lipids with high diagnostic ability

为进一步对以上9种差异脂质进行确认，采用脂质标准品的母离子及其碎裂信息与数据库一级和二级质谱图信息进行匹配，同时比较其与实际样品保留时间的误差。由于目前缺乏SM d40∶3、SM d36∶0、TAG 58∶1、PC 34∶2、PC 36∶6、PC 38∶7商品化的脂质标准品，因此只对棕榈酸乙醇胺、棕榈酸、鞘氨醇3种脂质进行LC-MS/MS验证。结果发现，脂质标准品与数据库的一级和二级质谱图匹配结果良好，同时其与样品保留时间的误差均小于0.1 min（图3、4），因此，上述3 种差异脂质可作为CRC诊断的潜在血清脂质标志物。

通过对以上9 种差异脂质的QC 归一化峰强度进行比较，进一步明确其在组间的水平变化趋势。结果表明，6 种差异脂质（包括棕榈酸乙醇胺、棕榈酸、SM d40∶3、PC 34∶2、SM d36∶0、鞘氨醇）在CRC 组中水平显著上调，3种差异脂质（包括TAG 58∶1、PC 36∶6、PC 38∶7）在CRC 组中显著下调，表明对CRC 呈现高诊断效能的潜在标志物主要是在CRC 血清中明显上调的差异脂质，且主要属于脂肪酸类、磷脂酰胆碱类和鞘磷脂类脂质成分（图5）。

图4 3种高诊断效能差异脂质的LC-MS/MS验证Fig.4 Identification of 3 differential lipids with high diagnostic ability by LC-MS/MS method

图5 9种高诊断效能差异脂质的组间变化趋势Fig.5 Change trend of nine differential lipids with high diagnostic ability the relative concentration of differential lipids was presented as mean±SEM

2.4 讨 论

本研究对NR 和CRC 患者的血清样本进行脂质组学分析，共发现155种差异脂质，其中9种差异脂质对CRC 具有良好的诊断效能（AUC ＞0.80），可作为CRC 的潜在诊断标志物。此外，在差异脂质中，PC和TAG占比高达57.42%，提示这两类脂质代谢紊乱可能与CRC的形成有关。

虽然部分研究已报道CRC 患者血浆和组织中潜在的脂质标志物和脂质代谢紊乱。然而，大部分脂质标志物均未被证实，且通过大样本血清脂质组学探索CRC 诊断生物标志物的研究相对较少。磷脂是脂质的主要成分，参与细胞膜的生成、代谢和细胞信号传导。磷脂的失调和肿瘤的发展密切相关［13-14］，也是报道最多的针对CRC 诊断的潜在脂质标志物［15-17］。Shen等［11］通过分析25例CRC 患者和10例NR 对照者血浆中的脂质种类，共发现64种差异脂质，其中PG（34∶0）、SM（42∶2）、Cer（44∶5）、LPC（18∶3）、LPC（18∶2）、PE（O-36∶3）、PE（O-38∶3）和SM（38∶8）被认为是CRC 的潜在脂质标志物，其大部分为磷脂类脂质。同时，PC 已被证实在CRC 细胞系中显著上调［13］，然而，其降解产物LPC 却在CRC 患者血浆中显著下调，且与体重减少密切相关［18］。本研究中，磷脂也是主要的差异脂质，在所有差异脂质中，PC 占比最高为30.32%，且其占比为潜在生物标记物的5/9，对CRC 具有良好的诊断性能（AUC ＞0.80）。因此，磷脂可作为CRC 的潜在生物标志物。此外，磷脂还具有一定的抗肿瘤活性，但其在单一治疗研究中的治疗潜力较低，仍需要进一步研究证实磷脂在CRC化疗中的作用与优势［19］。

TAG 是细胞膜脂质合成所必需的，也是目前公认的许多癌症的标志物，它不仅与癌细胞的病理生理特征有关，而且参与肿瘤的产生和恶化［20］。目前，有关血中TAG水平与CRC关系的研究结果仍存在争议。据报道，血浆或血清的TAG 水平升高与结直肠腺瘤（CRC 重要的癌前病变）的发病风险密切相关［21-22］，而部分研究证明血清或血浆的TAG水平与CRC发病风险并无明显关联［23-24］。另外，CRC组织中TAG 54∶0 的含量相对于良性腺瘤组织显著下调，而相对于正常组织则显著上调［25］。晚期结直肠癌患者血浆中的TAG 水平较早期结直肠癌患者升高［20］。本研究发现差异TAG 对CRC 和NR 组展现良好的区分性能，且其占所有鉴别差异脂质的27.10%，也是主要的紊乱脂质成分（图2）。此外，脂肪酸和鞘脂也是CRC 常见的脂类标记物。蜡酸（26∶0）［26］和长链脂肪酸［27］只在CRC 血清中存在，其可区分早期和晚期癌症［28］，或作为CRC 生存的预测指标［29］。文献显示，一种质荷比为742.988 69的鞘磷脂可作为监测晚期CRC 癌的血浆候选生物标志物［30］，本研究也观察到类似的结果，脂肪酸和鞘脂占所有差异脂质的23.87%，且3 种鞘脂和2 种脂肪酸类脂质对CRC 表现良好的诊断效能。说明TAG、FA 和SM 亦可作为CRC临床诊断的潜在脂质标志物。

3 结 论

CRC 的诊断和治疗是降低其死亡率的有效途径，脂质组学技术在肿瘤诊断标志物和机制探索研究中表现出巨大潜力。本研究利用UHPLC-Q Exactive-Orbitrap MS 技术的高通量和高分辨率优势，结合单因素和多元统计分析揭示CRC 与NR 组的血清脂质谱差异，筛选获得155 种组间差异脂质，且以PC 和TAG 为主，表明其代谢在CRC 中出现明显紊乱，可能参与CRC 的形成。此外，ROC 分析发现共有9种差异脂质对CRC 具有良好的诊断效能，可以选择其进行联合使用作为CRC 的诊断标志物。本实验为深入研究CRC的脂质特征提供了基础数据，对于CRC的临床筛查和诊断具有较高的参考价值。但由于临床样本数量和脂质标准品的限制，将本发现应用于临床尚需进一步验证。