高效液相色谱法测定食用植物油中TBHQ、BHA和BHT的含量

宁 炜

（山西省检验检测中心（山西省标准计量技术研究院），山西太原 030012）

随着我国社会经济稳步提升，人们的生活水平明显改善，食用植物油作为国民日常生活中的必需品，其使用量逐年增加，而近年来与食用植物油相关的食品安全事件也频频发生。食用植物油在存放过程中易发生氧化变质，生产企业往往会添加抗氧化剂以防止或延缓油脂氧化，达到提高食用油稳定性，延长保质期的目的[1]。目前，国内食用油生产企业使用较多的为叔丁基对苯二酚（Tertbutylhydroquinone，TBHQ）、叔丁基对羟基茴香醚（Butyl hydroxyanisole，BHA）与 2,6-二叔 丁基对 甲 基 苯 酚（2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）这3种人工合成的酚类抗氧化剂。有研究表明，长期摄入添加TBHQ、BHA和BHT等抗氧化剂过量的食品对人体肝、脾、肾等器官有危害，也存在潜在的致癌、致畸风险，因此加强食用植物油中TBHQ、BHA和BHT的监管检测非常必要[2-3]。《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》（GB 5009.32—2016）[4]中规定高效液相色谱法、气相色谱质谱法、气相色谱法均可用于食用植物油中上述3种抗氧化剂的检测，油脂样品经有机溶剂溶解提取后，用凝胶渗透色谱脱脂净化，然而凝胶渗透色谱仪器价格昂贵，净化周期较长，耗费试剂较多。本研究结合实验室现有条件设备，建立了食用植物油样品用有机试剂溶解提取、固相萃取柱净化、高效液相色谱测定其中TBHQ、BHA和BHT含量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米油[嘉里粮油（天津）有限公司]；TBHQ标准品（纯度99.5%）、BHA标准品（纯度99.4%）、BHT标准品（纯度100%），均由北京曼哈格生物科技有限公司提供；甲酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）和正己烷（色谱纯），均由美国飞世尔试剂公司提供；无水硫酸钠[分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司]；实验室用水为一级超纯水。

1.2 仪器与设备

1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器，美国安捷伦公司；MS105DU电子天平，精度0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司；XS204电子天平，精度0.1 mg，瑞士梅特勒托利多公司；VORTEX MS3旋涡混合仪，德国艾卡公司；TDL-5-A低速离心机，上海安亭科学仪器厂；P/N Hei-VAP Precision ML/G3旋转蒸发仪，德国海道夫公司；W-SPE12固相萃取装置，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；C18固相萃取柱，杭州微米派科技有限公司；Synergy超纯水机，德国密理博公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

（1）混合标准储备液。精密称取49.66 mg TBHQ标准品，53.22 mg BHA标准品，50.03 mg BHT标准品于50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制得TBHQ质量浓度为988.23 μg/mL、BHA质量浓度为1 058.01 μg/mL、BHT 质量浓度为 1 000.60 μg/mL 的混合标准溶液。

（2）混合标准工作系列。准确吸取0.5 mL上述混合标准溶液于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配制得TBHQ质量浓度为49.41 μg/mL、BHA质量浓度为52.90 μg/mL、BHT质量浓度为50.03 μg/mL的混合标准中间溶液。再用超纯水稀释配制成不同的浓度梯度，见表1。

表1 3种抗氧化剂混合标准工作系列浓度（单位：μg/mL）

1.3.2 试样处理过程

精密称取1 g（精确至0.001 g）混合均匀的试样于50 mL离心管中，加入5 mL乙腈饱和正己烷溶液溶解，用旋涡混合仪涡旋1 min，静置10 min。用5 mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2 min，再于3 000 r/min的离心机中离心5 min，收集乙腈层于试管中。重复使用5 mL正己烷饱和乙腈溶液涡旋提取2次，合并3次提取液，待净化，同法制备试样空白。

在C18固相萃取柱中装入2 g无水硫酸钠，加入5 mL甲醇活化萃取柱，再以5 mL乙腈平衡萃取柱，弃去流出液。将待净化的提取液全部倾入柱中，弃去流出液，再以5 mL乙腈+甲醇（2+1）混合溶液洗脱，将全部洗脱液收集于试管中，于40 ℃下用旋转蒸发仪浓缩至近干，加入2 mL乙腈定容，过0.22 μm有机系滤膜，上机测定。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.5%甲酸水溶液+甲醇，梯度洗脱，见表2；流速：1.0 mL/min；柱温：45 ℃；DAD检测器波长：280 nm；进样量：5 μL。

表2 液相色谱的梯度洗脱条件

2 结果与分析

2.1 方法的线性关系

分别将3种抗氧化剂混标1～混标5、混标5～混标9按照1.4色谱条件进行测定，以混标工作系列浓度点为横坐标，相对应测得的目标峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。由表3可知，3种抗氧化剂组分在各自浓度范围内线性良好，相关系数r均大于0.999。

表3 3种抗氧化剂的线性关系

2.2 加标回收率与精密度

在阴性玉米油试样中，结合方法线性范围与《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[5]规定植物油中3种抗氧化剂的最大使用量，添加低、中、高3个浓度水平的混标溶液，按照1.3.2试样处理过程操作，1.4色谱条件测定，每个浓度水平进行6次平行试验，计算方法的回收率与精密度。由表4可知，TBHQ的回收率为89.81%～105.16%，RSD为0.15%～4.36%；BHA的 回 收 率 为94.18%～ 109.50%，RSD为 0.12%～ 3.50%；BHT的回收率为102.61%～108.90%，RSD为0.28%～3.32%，均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[6]中的规定。

表4 3种抗氧化剂的回收率与精密度

2.3 方法的检出限与定量限

精密称取1 g阴性玉米油试样，加入0.03 mL 1.3.2中混合标准中间溶液，按照1.3.2试样处理过程操作，1.4色谱条件测定，色谱峰面积大于3倍仪器噪音，计算得出TBHQ的检出限为0.74 mg/kg，BHA的检出限为0.79 mg/kg，BHT的检出限为0.75 mg/kg，根据加标回收率试验中低浓度回收率结果可知该方法中3种抗氧化剂定量限均为4 mg/kg。

3 结论

本研究参照GB 5009.32—2016中高效液相色谱法，建立了高效液相色谱法测定食用植物油中TBHQ、BHA和BHT3种抗氧化剂含量的方法，使用固相萃取柱净化使得净化过程较为简便，有效提升了检测效率，通过进一步对线性关系、加标回收率和精密度、检出限与定量限等进行方法学验证，该方法线性关系良好，准确度及精密度等均符合相关标准要求，可以满足检验检测机构对食用植物油中TBHQ、BHA和BHT的日常检测。