液相色谱-串联质谱法测定食品中那可丁的不确定度评定

白德奎，许娟娟，刘青洋，文 才，赵何莲

（绵阳市产品质量监督检验所，四川绵阳 621000）

那可丁是一种有机化合物，最早是从罂粟属植物鸦片中提取得到，主要作为镇咳药使用，食品中的那可丁来源于常见的肉制品、酱料以及调味料等[1]。因罂粟壳中含有的多种生物碱能引起某种程度的惬意和快感，长期摄入会产生严重的依赖性且危害人体健康。因此，《中华人民共和国食品安全法》明令禁止在食品中添加。目前，那可丁的测定通常采用液相色谱-串联质谱法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS-MS），本文参照标准《食品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定》（BJS 201802）[2]和测定不确定度评定与表示相关标准[3-4]，对液相色谱-串联质谱法测定那可丁含量的测量不确定度进行评定，确定影响检测结果的不确定度的主要影响因子，为今后的质检工作提供工作关键控制点。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪；离心机；粉碎机；超声波清洗器；涡旋混合器；分析天平；匀浆机。

甲醇（优级纯）；乙腈（优级纯）；甲酸（优级纯）；盐酸；甲酸铵（优级纯）；无水醋酸钠；无水硫酸镁。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

称取2.00 g样品置于50 mL具塞离心管（聚四氟乙烯）中，液体（半固体）样品加入1.00～3.00 mL水，固体样品加入5.00 mL盐酸溶液。涡旋振荡30 s，准确加入15.00 mL乙腈，密塞，涡旋振荡1 min，超声处理30 min，加入6.00 g无水硫酸镁和1.50 g无水醋酸钠的混合粉末，立即涡旋振荡2 min后以4 000 r/min离心5 min，取上清液，以0.22 μm滤膜过滤，样品待测。

1.2.2 标准工作溶液的配制

分别移取1 μg/mL那可丁标准溶液0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL和1.00 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈溶液定容，即得系列标准工作溶液。

1.2.3 测定方法

采用《食品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定》（BJS 201802）中规定的方法测定那可丁含量。

1.2.4 不确定度数学模型

以标准工作溶液的浓度为横坐标，以那可丁峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。利用校准曲线回归方程计算样品中的那可丁含量。那可丁定量检测的数学模型如下：

式中：X为样品中那可丁的含量，μg/kg；C为由标准曲线计算出试样定容溶液中那可丁的浓度，ng/mL；V为样品的最后定容体积，mL；m为样品的质量，g。

2 不确定度评定

根据检测流程及数学模型，该方法测定的不确定度因素主要包括样品前处理过程、标准溶液配制、标准曲线拟合、样品检测以及回收率。

2.1 样品前处理过程引入的测量不确定度urel(C1)

2.1.1 分析天平称量引入的测量不确定度urel(m)

（1）分析天平示值误差引入的测量不确定度urel(m1)。校准证书给出分析天平的允许误差限为0.05 g，用均匀分布计算，包含因子为。每个样品称量过程相互独立，共计4次，分析天平示值误差引入的标准不确定度为称量样品2.00 g，分析天平示值误差引入的相对标准不确定度为

（2）分析天平的偏载误差引入的测量不确定度urel(m2)。校准证书给出天平偏载允许误差限为0.1 g，每个样品称量过程相互独立，使用电子天平称量4次，标准不确定度为分析天平的偏载误差引入的相对标准不确定度为

（3）分析天平重复称量引入的测量不确定度urel(m3)。校准证书给出天平偏载允许误差限为0.15 g，每个样品称量过程相互独立，使用电子天平称量4次，标准不确定度为分析天平重复称量引入的相对标准不确定度为

因此，分析天平称量引入的相对标准不确定度为：

2.1.2 样品前处理过程移液管引入的测量不确定度urel(P)

根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[5]样品前处理过程移液管引入的不确定度分量见表1。样品前处理过程移液管引入的相对标准不确定度为0.007 25。

表1 样品处理过程移液管引入的相对标准不确定度

2.1.3 空白样品测量引入的测量不确定度urel(B)

空白样品测量只涉及移液管的使用，故引入的测量不确定度等同于移液管引入的相对标准不确定度，即urel(B)=0.007 25。

综上可知，样品前处理过程引入的相对标准不确定度为：

2.2 标准溶液配制引入的不确定度urel(C2)

（1）标准使用液引入的测量不确定度urel(S)。检测用那可丁标准物质（1ST45021），质量浓度为10 μg/mL，相对扩展不确定度为Ur=5%（k=2）。则标准使用液引入的相对标准不确定度为

（2）容量瓶引入的测量不确定度urel(V)。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）中表6的要求，容量为10 mL的A级单标线容量瓶的最大示值允许误差为0.020 mL，共使用5次。标准不确定度为容量瓶引入的相对标准不确定度为

（3）移液枪引入的测量不确定度urel(G)。根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[6]的要求，使用移液枪配制标准曲线产生的不确定度分量见表2。移液枪引入的相对标准不确定度为0.020 8。

表2 样品处理过程移液枪产生的不确定度

因此，标准溶液配制引入的相对标准不确定度为：

2.3 标准曲线的测量不确定度urel(C3)

标准曲线拟合方程为y=6.613×104x+9.598×104；r=0.999 0）。由表3可知，标准曲线中，x-=38.00，y-=2 608 776.8。观测值和理论值的对应关系见表4。

表3 标准曲线测定结果表

表4 观测值与理论值对应关系表

标准曲线残余残差公式为：

样品含量标准偏差公式为：

式中：n为浓度点个数；由于回归偏差平方和的自由度只与斜率a有关，其自由度为n-2。p为被测物测量平行次数；x-s为被测物测量平均值，ng/mL。

试验中测定两次得到被测物的信号强度分别为2 002 407、2 013 631，代入校准曲线均值为x-s=28.91 ng/mL。由公式（2）得到标准曲线残余残差S=124 142.93，由公式（3）得到被测物含量标准偏差S(x0)=1.58。则校准曲线引入的相对标准不确定度为

2.4 回收率引入的测量不确定度urel(C4)

回收率的分量包含仪器响应和重复性。仪器响应包含在重复性中，故可直接利用回收率的重复性标准偏差表示回收率的测量不确定度。实验中共检测回收率3次，得到的平均回收率x-=104.8%，标准偏差S=4.10。相对标准不确定度为urel(C4)=0.039 1。

2.5 样品检测引入的测量不确定度urel(C5)

样品检测的测量不确定度分为仪器响应和检测的重复性。仪器响应包含在重复性中，只需评定检测的重复性即可，结果见表5。样品检测引入的相对标准不确定度为0.015 6。

表5 样品检测的测量不确定度

2.6 扩展不确定度

通过计算可得，那可丁的合成标准不确定度为：

取包含因子k=2，方法的相对扩展不确定度为U=kurel(C)=0.260 4，液相色谱-串联质谱法检测食品中那可丁的含量为221.5 μg/kg，扩展不确定度为U=0.260 4×221.5=57.7 μg/kg。因此，食品中的那可丁测定结果为（221.5±57.7）μg/kg，k=2。

3 结论

本实验中试样中的那可丁含量表示为（221.5±57.7）μg/kg，k=2。通过对液相色谱-串联质谱法测定那可丁含量的测量不确定评定来源进行分析和评定发现，在测定过程中样品前处理、标准溶液配制和标准曲线拟合对样品检测的不确定度影响较大，而其余不确定度分量影响不大。