雌性红莱菔对急性痛风性关节炎模型大鼠抗炎作用及激活TLR/MyD88/IL-1β信号通路作用机制的研究

梁再赋　索德宝　冯晓明　张瑞君　张啸　赵云玲　高明利

【摘 要】目的：通過TLR/MyD88/IL-1β 信号通路探讨雌性红莱菔对尿酸钠致急性痛风性关节炎（AGA）模型大鼠的抗炎作用机制。方法：通过大鼠右踝胫跗关节注射尿酸钠结晶溶液（MSUC），建立AGA大鼠模型，雌性红莱菔低、中和高剂量组和依托考昔组给予相应剂量药物灌胃，空白对照组、模型对照组给予等量的生理盐水灌胃，每日1次，疗程5 d。末次灌胃1 h后，采血分离血清及大鼠右踝胫跗关节组织固定包埋。免疫组化法检测AGA模型大鼠白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量;HE染色及免疫组化技术检测大鼠踝关节滑膜组织的病理变化、滑膜肥大细胞数量及活化状态变化、P物质阳性神经纤维数量和Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）分子的表达。结果：雌性红莱菔各剂量组可依剂量变化相应地降低AGA模型大鼠IL-1β、TNF-α水平（P < 0.01）。雌性红莱菔各剂量组可依剂量变化相应地降低AGA模型大鼠滑膜部位肥大细胞数量、活化肥大细胞数量及脱颗粒百分率（P < 0.01）。雌性红莱菔各剂量组可依剂量变化相应地降低AGA模型大鼠滑膜P物质阳性神经纤维的分布密度（P < 0.01）。雌性红莱菔各剂量组可依剂量变化相应地降低AGA模型大鼠关节滑膜组织中TLR2、TLR4和MyD88分子表达（P < 0.01）。结论：雌性红莱菔能够减轻AGA模型大鼠踝关节的炎症反应;滑膜部位肥大细胞活化及P物质免疫反应阳性神经纤维可能参与痛风性关节炎的炎症反应及疼痛传导;雌性红莱菔可通过降低TLR/MyD88/IL-1β通路分子的表达发挥其抗炎作用。

【关键词】 急性痛风性关节炎;雌性红莱菔;抗炎;TLR/MyD88/IL-1β信号通路;作用机制

Anti-inflammatory Effect of Female Red Radish on Model Rats with Acute Gouty Arthritis and Its Mechanism of Activating Signal Pathway TLR/MyD88/IL-1β

LIANG Zai-fu，SUO De-bao，FENG Xiao-ming，ZHANG Rui-jun，ZHANG Xiao，ZHAO Yun-ling，GAO Ming-li

【ABSTRACT】Objective：Through signal pathway TLR/MyD88/IL-1β，to explore the anti-inflammatory mechanism of female red radish on acute gouty arthritis（AGA）model rats induced by sodium urate.Methods：AGA rats models were established by injecting mono sodium urate crystal（msuc）solution into the tibiotarsal joints of the right ankles of rats.Rats in the low，medium and high dose groups of female red radish and the etocoxib group were given corresponding doses experimental drugs by gavage once a day.The blank control group and model control group were given the same amount of normal saline by gavage.Five days as a course of treatment.One hour after the last gavaging，the blood was taken to separate the serum and the tissue of the tibiotarsal joints of the right ankles of rats were fixed and embedded.The contents of IL-1β and TNF-α in AGA model rats were detected by ELISA.The pathological changes，the number and activation of synovial mast cells，the number of SP positive nerve fibers and the expressions of TLR2，TLR4 and MyD88 molecules were detected by HE staining and immunohistochemistry.Results：Each dose group of female red radish could reduce the levels of IL-1β and TNF-α in AGA model rats according to the dose change（P < 0.01）.The number of mast cells in synovium，the number of activated mast cells and the percentage of degranulation in AGA model rats could be reduced correspondingly in each dose group of female red radish（P < 0.01）.The distribution density of SP positive nerve fibers in the synovium of AGA model rats could be reduced correspondingly in each dose group of female red radish（P < 0.01）.The expressions of TLR2，TLR4 and MyD88 molecules in articular synovium of AGA model rats could be reduced correspondingly in each dose group of female radish（P < 0.01）.Conclusion：Female red radish can reduce the inflammatory reaction of ankle joint in AGA model rats.The activation of mast cells and SP immunoreactive nerve fibers in synovium may be involved in the inflammatory response and pain conduction of gouty arthritis.Female red radish can reduce the expression of pathway molecules TLR/MyD88/IL-1β to play its anti-inflammatory role.

【Keywords】acute gouty arthritis;female red radish;anti-inflammatory;signal path TLR/MyD88/IL-1β;

function mechanism

随着人民生活水平的提高，我国痛风的发病率逐年上升，目前高达1.1%，给国人健康带来诸多的不良影响[1]。但现行痛风指南推荐的常规药物因存在诸多不良反应，一定程度地限制了临床应用。因此，研制高效低毒的抗痛风新药是目前研究的热点之一。笔者的前期实验结果提示，雌性红莱菔可激活急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）大鼠模型核因子NF-E2相关因子-抗氧化反应元件（Nrf2-ARE）通路，使机体的抗氧化酶产生增加，达到对AGA大鼠模型的抗氧化应激作用[2-3]。笔者拟明确雌性红莱菔对AGA大鼠模型是否具有抗炎作用及可能的作用机制，揭示雌性红莱菔治疗AGA的作用靶点及机理，为其防治AGA提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 选取健康SPF级SD雄性大鼠48只，体质量（320±40）g，购于辽宁（本溪）长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号SYXK（辽）2013-0009。大鼠均饲养于正常生活环境下，饲料喂养，予自由饮食、饮水。

1.2 实验药品与仪器 依托考昔片（美国默沙东公司，产品批号N014801，规格120 mg）;雌性红莱菔浓缩原粉（沈阳抗风竤生物技术有限公司，食准字SC11712011603862，规格1 g）;尿酸钠盐（美国Sigma-Aldrich公司）;大鼠IL-1β及TNF-α检测ELISA试剂盒（武汉优尔生贸易有限公司）;兔抗大鼠TLR2、TLR4、MyD88多克隆抗体、辣根酶标记羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂（武汉博士德生物工程有限公司）;1%甲苯胺蓝溶液（雷根生物有限公司）;即用型免疫组化SP试剂盒（小鼠/兔）（福州创新生物技术开发有限公司）;小鼠抗SP多克隆抗体[艾博抗（上海）贸易有限公司];JY5002电子天平（上海精密科学仪器有限公司）;TDL-40B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）;101-2A数显式电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器公司）;anthos 2010全自动酶标仪（奥地利 AnthosLabtecInstruments）;BA200，4X-100X数码显微系统Ⅱ-显微镜（厦门麦克奥迪实业集团有限公司）。实验仪器均由中国医科大学科学实验中心一部提供。

2 方 法

2.1 动物分组和AGA大鼠模型建立 按文献[2]方法进行。将48只SD大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，依托考昔组，雌性红莱菔低、中、高剂量组，每组8只。配置10 mL尿酸钠结晶溶液（MSUC）混悬溶液，将10%水合氯醛溶液，按照0.3 mL·（100 g）的剂量大鼠皮下注射，以镇静催眠，再以无菌操作的方法，用1 mL注射器针头分别在模型对照组，依托考昔组，雌性红莱菔低、中、高剂量组大鼠右踝的胫跗关节腔内，以45°注射0.2 mL的MSUC，建立AGA大鼠模型。空白对照组在右踝内注入相同体积的生理盐水。

2.2 药物用量和给药方式 按文献[2]方法进行。大鼠适应性喂养7 d后，根据人和动物的体表面积计算法，雌性红莱菔低、中、高剂量组分别给予雌性红莱菔208.33 mg·kg·d、416.67 mg·kg·d、625 mg·kg·d灌胃，依托考昔组给予依托考昔12.5 mg·kg·d灌胃，空白对照组及模型对照组则以生理盐水灌胃，灌胃量按照大鼠体质量计算，每日1次，疗程5 d。

在用药治疗的第3天，建立AGA大鼠模型。

2.3 血清中IL-1β和TNF-α含量测定 大鼠于末次灌胃1 h后麻醉处死，经腹主动脉采血，置4℃冰箱凝固，再离心后收集上层血清，置-80℃冰箱保存待测。用免疫組化法测定血清中白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量。

2.4 大鼠关节滑膜组织的病理变化和TLR2、TLR4、MyD88分子表达的测定 采血后，剪取大鼠右后足内踝胫跗关节（关节近端及远端各保留约0.5 cm），去皮，常规组织处理、石蜡包埋切片，HE染色法观察大鼠关节滑膜组织的病理变化。

免疫组化法测定大鼠关节滑膜组织Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）分子的表达，计量方法为每张切片取5个高倍视野（×400）镜检，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定各组平均积分光密度值（IOD），计算平均IOD值。

2.5 大鼠关节滑膜肥大细胞及脱颗粒观察 按文献[4]方法进行。石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后，用0.5%甲苯胺蓝液染色10 min，水洗后入冰醋酸液化直到胞核和颗粒清晰，常规脱水、透明后封片。染色切片由1名病理医师于光学显微镜下盲法观察滑膜肥大细胞（MC）形态并计数。形态判定方法：细胞膜完整、细胞核染色清楚的为稳定状态MC;细胞膜破裂、周围组织中存在蓝染状颗粒的为脱颗粒MC。计数方法为：每张切片在高倍视野（×400）下选取MC数目最多的3个视野进行计数，计算单位面积（mm）内MC数量、活化MC数量和脱颗粒百分率。脱颗粒百分率=（脱颗粒MC数/MC总数）×100%。

2.6 P物质阳性神经纤维染色 按文献[4]方法进行。采用免疫组化法测定大鼠关节滑膜组织P物质（SP）免疫反应阳性神经纤维，计数方法为：每张切片在高倍视野（×400）下选取SP阳性神经纤维数目最多的3个视野进行计数，计算单位面积（mm）内SP阳性神经纤维的分布密度。

2.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法进行多组均数间的两两比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠踝关节滑膜组织形态比较 空白對照组大鼠踝关节滑膜组织形态、组织结构正常;模型对照组滑膜肿胀，细胞可见明显增生，结构排列紊乱，并伴有大量白细胞浸润，可见小血管生成及成纤维细胞;依托考昔组滑膜组织轻度肿胀，细胞轻度增生，结构排列稍显紊乱，可见少量白细胞浸润及少量成纤维细胞;雌性红莱菔低剂量组滑膜组织肿胀，细胞增生，结构排列较紊乱，可见白细胞浸润及小血管生成;雌性红莱菔中剂量组滑膜组织肿胀细胞增生，结构排列较紊乱，可见白细胞浸润及成纤维细胞;雌性红莱菔高剂量组滑膜组织轻度肿胀，细胞轻度增生，结构排列稍显紊乱，可见少量白细胞浸润及少量成纤维细胞。雌性红莱菔可明显减轻踝关节滑膜组织的炎症反应。见图1。

3.2 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比较 模型对照组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显高于空白对照组（P < 0.01）;依托考昔组、雌性红莱菔各剂量组血清IL-1β、TNF-α水平均明显低于模型对照组（P < 0.01）;雌性红莱菔低、中剂量组血清IL-1β水平高于依托考昔组（P < 0.05），高剂量组与依托考昔组相当;雌性红莱菔低、中剂量组血清TNF-α水平降低程度与依托考昔组相当，高剂量组TNF-α水平明显低于依托考昔组（P < 0.05）。见表1。

3.3 各组大鼠关节滑膜组织TLR2、TLR4、MyD88分子表达比较 模型对照组大鼠关节滑膜组织中TLR2、TLR4、MyD88分子表达明显高于空白对照组（P < 0.01）;依托考昔组、雌性红莱菔各剂量组TLR2、TLR4、MyD88分子表达明显低于模型对照组（P < 0.01）;雌性红莱菔低、中剂量组降低TLR2、TLR4、MyD88分子表达效果低于依托考昔组（P < 0.01），而高剂量组降低TLR2、TLR4、MyD88分子表达效果与依托考昔组相当;雌性红莱菔各剂量组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3.4 AGA模型大鼠关节滑膜组织TLR2、TLR4、MyD88分子表达与IL-1β、TNF-α水平的相关性分析 AGA模型大鼠关节滑膜组织TLR2、TLR4、MyD88分子的表达与血清IL-1β、TNF-α水平均呈正相关性，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表3。

3.5 各组大鼠滑膜MC数量及脱颗粒百分率比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠滑膜部位的MC数量、活化MC数量及脱颗粒百分率明显增加（P < 0.01）;依托考昔组MC数量、活化MC数量及脱颗粒百分率显著低于模型对照组（P < 0.01），其总数和脱颗粒百分率接近空白对照组;雌性红莱菔各剂量组可依剂量变化相应地降低模型大鼠滑膜部位MC数量、活化MC数量及脱颗粒百分率（P < 0.01）;雌性红莱菔低、中各剂量组降低MC数量及其脱颗粒效果低于依托考昔组（P < 0.01），而雌性红莱菔高剂量组降低滑膜MC数量及其脱颗粒效果与依托考昔组相当;雌性红莱菔各剂量组间降低大鼠滑膜MC数量及其脱颗粒效果差异均有统计学意义（P < 0.01）。见表4。

3.6 各组大鼠滑膜SP阳性神经纤维数比较 空白对照组大鼠关节滑膜中有一定数量SP阳性神经纤维的分布;模型对照组大鼠滑膜部位的SP阳性神经纤维数量显著增加（P < 0.01）;依托考昔组SP阳性神经纤维显著减少，但仍高于空白对照组，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）;雌性红莱菔各剂量组可依剂量变化相应地降低模型大鼠SP阳性神经纤维的分布密度（P < 0.01）;低、中剂量组降低效果低于依托考昔组（P < 0.01），而高剂量组降低效果与依托考昔组相当;雌性红莱菔各剂量组间降低大鼠滑膜SP阳性神经纤维的分布密度效果差异有统计学意义（P < 0.01）。见表5。

4 讨 论

中医学认为，痛风内因先天禀赋不足，外因风寒湿热等外邪入侵，致湿热内蕴浊毒或脏腑积热蕴毒，热毒、浊毒攻注着附骨节、留滞血脉而发病[5]。莱菔是萝卜的炮制品，其功效为驱寒除湿、活血化瘀、滋阴补肾、理气健脾等，可广泛用于风寒湿痹、风湿热痹及痹证久病不愈导致的正气不足[6]。因此，莱菔具有防治痛风的理论基础。

莱菔中含有丰富的莱菔硫烷（SFA）[7]、莱菔素（SFE）[8]、类黄酮、烯酸等活性物质，均具有较强的抗氧化性[9-10]，可在抗AGA中发挥重要作用。

MSU能类似于外源性的佐剂被TLR所识别，激活的TLRs募集MyD88后，相继活化IL-1受体相关激酶、TGF-β活化激酶，进而激发IκB激酶级联反应，激活核转录因子，从而启动与炎症免疫有关的IL-1β、TNF-α等基因的表达，产生大量IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子[11]。王婧等[12]发现莱菔硫烷可抑制TLR/MyD88信号通路，明显降低TNF-α含量。本实验结果也表明，雌性红莱菔能够抑制AGA大鼠模型滑膜组织中TLR2、TLR4、MyD88分子的表达，降低AGA大鼠IL-1β、TNF-α水平，AGA大鼠模型滑膜组织中TLR2、TLR4、MyD88分子的表达与AGA大鼠IL-1β、TNF-α水平呈正相关。因此，笔者认为雌性红莱菔中的莱菔硫烷可能通过抑制AGA大鼠模型滑膜组织中TLRs/MyD88/IL-1β信号通路，降低IL-1β、TNF-α水平，减轻AGA大鼠踝关节的炎症反应。

SP物质是机体受伤害后传入末梢释放的一种兴奋性递质，与疼痛直接相关。SP表达及其受体分布在骨关节患者出现异常改变，DIRMEIER等[13]发现骨关节炎和类风湿关节炎患者关节SP含量升高，表明SP在骨关节炎发病机制中的重要作用。

MC在痛风的病变过程中起着重要的作用，可通过释放组胺、蛋白水解酶、花生四烯酸产物以及细胞因子等炎性介质，维持或加重滑膜炎症及对关节结构的破坏[14]。有研究表明，某些类黄酮物质可抑制SP的释放[15]，同时抑制MC的活化[16]。本实验结果也显示，雌性红莱菔可不同程度的减少AGA模型大鼠踝关节滑膜组织中MC數量、脱颗粒百分率及SP阳性神经纤维数，这可能是雌性红莱菔中类黄酮物质作用的体现。

综上所述，雌性红莱菔可能是通过其含有的多种有效成分，多靶点、综合作用于机体，发挥抗炎、止痛的治疗作用。

中药通常是通过多层次、多靶点、多环节作用于机体而发挥作用，而由于条件限制，雌性红莱菔中有效物质的定量分析尚未开展，其治疗AGA的作用机制尚未完全阐明，应选用高尿酸血症、尿酸性肾病等动物模型从尿酸生成、排泄等方面进行深入研究，通过血清药理学、网络药理学、代谢组学等技术从细胞、基因、分子层面进一步探讨雌性红莱菔的药效物质及作用靶点，目前上述研究工作正在进行中。本研究的意义不仅是丰富和完善中医药防治痛风性关节炎理论，阐明临床中药有效的科学内涵，且目前国内外类似研究报道尚少，故本研究可能为开发能够抗痛风的中药新药奠定理论基础，因而具有重要的理论意义和临床应用价值。

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