BMSCs调节TGF-β1/Smad通路对肝硬化大鼠免疫调节功能的作用研究

卢斯霞 胡旭东 高 欣 程 聪 陈 思 （华中科技大学同济医学院附属武汉金银潭医院肝病科，湖北省传染病临床医学研究中心，中国医学科学院武汉传染性疾病诊治研究中心，中国科学院武汉病毒研究所&武汉市金银潭医院感染性疾病与健康联合实验室，武汉 430010）

TGF-β1 是引起纤维化的关键因子，TGF-β1 可激活Smad，从而诱导纤维化相关基因转录和翻译，导致胶原蛋白（collagen，Col）大量表达，参与纤维化过程［1］。近年研究显示，机体免疫也参与肝纤维化过程，肝纤维化患者体内存在T淋巴细胞亚群改变，具有抗炎作用的T 辅助细胞17（T helper cells 17，Th17）比例提高，而具有抗炎作用的调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）水平则降低［2］。研究显示，Th17/Treg 平衡受TGF-β/Smad 通路调控［3］。骨髓间充质肝细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）可轻易从骨髓中收集并在体外扩增，并分化为多种细胞类型，且具有免疫耐受优势，在多种疾病治疗中发挥作用［4］。一项临床研究显示，通过门静脉给予BMSCs 可缓解乙型肝炎病毒相关慢性肝衰竭，并保护肝功能［5］。最新研究发现BMSCs可缓解由四氯化碳诱导的肝损伤和纤维化［6］。研究显示，BMSCs 可诱导Th17/Treg 平衡［7］。但BMSCs 对肝纤维化的影响及作用机制尚不明确。本文主要分析BMSCs 通过TGF-β1/Smad 通路对肝纤维化和免疫情况的影响，为临床更好地治疗肝纤维化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SD 大鼠（SPF 级，雄性，6 周龄，体质量210～230 g，北京维通利华动物公司）；四氯化碳、TRIzol（美国Sigma 公司）；DMEM 培养基和牛血清（美国Gibco-BRL 公司）；Ficoll 密度梯度培养基（德国Biochrom 公司）；FITC 偶联的抗大鼠CD29 抗体、PE偶联的抗大鼠CD34抗体以及CYTOMICS FC 500流式细胞仪（美国Beckman Coulter 公司）；ELISA 试剂盒、HE染色、Masson染色和TUNEL染色试剂盒（碧云天公司）；Model 680酶标仪、PVDF膜（美国Bio-Rad）；流式细胞仪及小鼠Treg/Th17 表型抗体试剂（美国Becton Dickinson 公司）；免疫磁珠（美国Invitrogen 公司）；组织匀浆机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；PrimeScript-RT 和SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（日本TaKaRa 公司）；RIPA 裂解缓冲液（北京Beyotime）；BCA 试剂盒（武汉博斯特生物技术有限公司）；抗体（美国Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 分离、纯化和鉴定 采用含10%牛血清的DMEM 冲洗大鼠整胫骨和股骨骨髓，根据Ficoll 密度梯度培养基说明书将冲洗的细胞重悬于完全培养基，37 ℃、5%CO2孵育14 d。细胞80%融合时，磷酸盐缓冲盐水洗涤2次并消化，为第一代细胞。当细胞传代到第4代时，分别采用CD29抗体和CD34抗体染色，暗中孵育30 min，流式细胞术鉴定。

1.2.2 大鼠分组、建模和干预 36 只大鼠随机分为对照组、模型组和BMSCs 组，每组12 只。模型组和BMSCs 组大鼠根据文献［8］构建肝纤维化模型：将四氯化碳溶于橄榄油，浓度为10%，腹腔注射，1 ml/（kg·次），2 次/周，连续8 周，对照组注射等量生理盐水。最后1次注射四氯化碳后尾静脉注射BMSCs（3×106个），移植后第4周处死大鼠进行检测［9］。

1.2.3 ELISA 检测肝功能 取大鼠尾静脉血5 ml，300 r/min离心15 min收集上清，根据试剂盒说明书加入抗体和显色剂，终止显色后15 min 内酶标仪检测450 nm处吸光度，根据标准曲线计算AST和ALT浓度。

1.2.4 HE 染色检测肝组织损伤 断头处死大鼠，收集肝动脉血管组织，多聚甲醛固定48 h，不同浓度乙醇脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋，切片（4 μm）。切片水化后制成玻片标本，加入苏木精孵育5 min，加入0.5%伊红染色5 min，洗涤后透化，固定，显微镜下观察。

1.2.5 Masson 染色检测纤维化 将1.2.4 的玻片标本加入Masson 三色染料染色，根据试剂盒说明书操作，显微镜下观察并拍照，IPP 6.0 图像分析系统计算胶原蛋白体积分数（collagen volume fraction，CVF）=胶原蛋白阳性蓝色面积/组织总面积×100%。

1.2.6 流式细胞术检测Th17和Treg水平 将外周血经过密度梯度离心后抽吸淋巴细胞层，获得单个淋巴细胞悬浮液。细胞用20 μl预冷的1×BD Mouse Foxp3 缓冲液4 ℃暗室固定30 min，洗涤固定剂并收集细胞，加入200 μl 通透缓冲液37 ℃避光孵育30 min，透化2 次后洗涤细胞，与20 μl 小鼠Treg/Th17 表型抗体试剂或对照抗体室温孵育30 min，洗掉抗体，重悬，FACSCalibur 流式细胞仪检测Th17 细胞和Treg占比。

1.2.7 RT-qPCR 检测mRNA 水平 密度梯度离心法分离单个核细胞，免疫磁珠分离淋巴细胞，TRIzol获得肝组织及淋巴细胞中总RNA，逆转录1 μg RNA为cDNA（42 ℃60 min，70 ℃5 min，4 ℃保存）。采用SYBR Green PCR Master Mix 和PCR 检 测 系 统 进 行qPCR 实验（95 ℃10 min，40 个循环，94 ℃15 s，60 ℃1 min，60 ℃1 min，4 ℃保存）。以GAPDH为内参，通过比较循环阈值分析mRNA表达。

两人在中南海愉快地住了几天，到北京城看了看，算是开了眼界，见了世面，然后就准备回湖南老家。临行前，毛泽东用自己的稿费为他们每人做了一套新衣服。

1.2.8 Western blot 检测蛋白表达 匀浆机均匀研磨肝组织及淋巴细胞萃取总蛋白，BCA 试剂盒测量浓度。分别取40 μg 总蛋白采用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（PAGE，80～120 V，90 min）。100 mV 恒定电压下湿转至PVDF 膜，5%牛血清白蛋白（BSA）中室温孵育1 h，加入一抗（1∶500 稀释）4 ℃孵育过夜，洗涤，添加二抗室温孵育1 h，化学发光试剂显影，以GAPDH 为内参，Image J 软件分析目标条带灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，数据以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs 鉴定结果 流式细胞术结果显示，CD29 和CD90 呈阳性，CD34 呈阴性，提示BMSCs 分离成功（图1）。

图1 流式细胞术鉴定BMSCsFig.1 Identification of BMSCs by flow cytometry

2.2 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠肝功能指标的影响 模型组大鼠ALT 和AST 水平显著高于对照组（P<0.05），BMSCs 组大鼠ALT 和AST 水平显著低于模型组（P<0.05，表1）。

表1 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠肝功能指标的影响（±s，n=12，U/L）Tab.1 Effect of BMSCs on liver function indexes of liver fibrosis model mice（±s，n=12，U/L）

表1 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠肝功能指标的影响（±s，n=12，U/L）Tab.1 Effect of BMSCs on liver function indexes of liver fibrosis model mice（±s，n=12，U/L）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

AST 109.43±10.64 252.67±25.491）174.82±21.902）86.315 0.000 Groups Control Model BMSCs F P ALT 38.62±421.00 142.35±17.181）85.18±10.442）136.743 0.000

2.3 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠肝组织损伤的影响 对照组大鼠肝组织染色均匀，细胞核呈圆形，排列有序，肝小叶结构清晰；模型组大鼠肝细胞膨大，肝小叶结构损伤，并出现严重出血和炎症浸润；BMSCs 组大鼠可观察到肝小叶结构，炎症浸润情况较模型组减轻（图2）。

图2 HE 染色检测BMSCs 对肝纤维化模型大鼠肝组织损伤的影响（×200）Fig.2 HE staining to detect effects of BMSCs on liver tissue damage in mice with liver fibrosis（×200）

2.4 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠肝纤维化的影响 红色为细胞，蓝色为被染色的Col 等纤维化组织。模型组大鼠CVF 水平显著高于对照组（P<0.05），BMSCs 组大鼠CVF 水平显著低于模型组（P<0.05，图3、表2）。

表2 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠肝纤维化的影响（±s，n=12）Tab.2 Effects of BMSCs on liver fibrosis in mice with liver fibrosis（±s，n=12）

表2 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠肝纤维化的影响（±s，n=12）Tab.2 Effects of BMSCs on liver fibrosis in mice with liver fibrosis（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

CVF/%0.91±0.12 11.47±1.451）4.82±0.792）159.431 0.000 Groups Control Model BMSCs FP

图3 Masson染色观察BMSCs对肝纤维化模型大鼠肝纤维化的影响（×200）Fig.3 Effect of BMSCs on liver fibrosis in mice with liver fibrosis detected by Masson staining（×200）

2.5 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠Col Ⅰ和Col ⅢmRNA 表达的影响 模型组大鼠Col Ⅰ和Col ⅢmRNA 表达平显著高于对照组（P<0.05），BMSCs 组Col Ⅰ和Col ⅢmRNA 表达显著低于模型组（P<0.05，表3）。

表3 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠Col Ⅰ和Col ⅢmRNA表达的影响（±s，n=12）Tab.3 Effects of BMSCs on expressions of Col Ⅰand ColⅢmRNA in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表3 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠Col Ⅰ和Col ⅢmRNA表达的影响（±s，n=12）Tab.3 Effects of BMSCs on expressions of Col Ⅰand ColⅢmRNA in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Col ⅢmRNA 1.22±0.12 5.84±0.551）3.09±0.282）162.799 0.000 Groups Control Model BMSCs FP Col ⅠmRNA 1.43±0.13 6.27±0.451）3.56±0.312）197.357 0.000

2.6 BMSCs对肝纤维化模型大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表达的影响 模型组大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ表达显著高于对照组（P<0.05），BMSCs 组Col Ⅰ和Col Ⅲ表达显著低于模型组（P<0.05，图4、表4）。

表4 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ表达的影响（±s，n=12）Tab.4 Effects of BMSCs on expressions of Col Ⅰand Col Ⅲin liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表4 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ表达的影响（±s，n=12）Tab.4 Effects of BMSCs on expressions of Col Ⅰand Col Ⅲin liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Col Ⅲ0.93±0.09 3.84±0.351）1.89±0.202）162.799 0.000 Groups Control Model BMSCs FP Col Ⅰ0.96±0.09 4.57±0.371）2.04±0.192）197.357 0.000

图4 Western blot检测BMSCs对肝纤维化模型大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ表达的影响Fig.4 Western blot detection of effect of BMSCs on expressions of Col Ⅰand Col Ⅲin liver fibrosis model rats

表5 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠TGF-β1 和Smad mRNA表达的影响（±s，n=12）Tab.5 Effect of BMSCs on expressions of TGF-β1 and Smad mRNA in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表5 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠TGF-β1 和Smad mRNA表达的影响（±s，n=12）Tab.5 Effect of BMSCs on expressions of TGF-β1 and Smad mRNA in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Smad mRNA 1.47±0.13 5.72±0.561）3.01±0.292）165.488 0.000 Groups Control Model BMSCs FP TGF-β1 mRNA 1.51±0.13 5.84±0.541）3.23±0.302）172.148 0.000

2.8 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠TGF-β1/Smad 通路中蛋白表达的影响 模型组大鼠TGF-β1和Smad蛋白表达显著高于对照组（P<0.05），BMSCs 组TGF-β1和Smad蛋白表达显著低于模型组（P<0.05，图5、表6）。

表6 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠TGF-β1/Smad 通路中蛋白表达的影响（±s，n=12）Tab.6 Effect of BMSCs on protein expressions of TGF-β1/Smad pathway in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表6 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠TGF-β1/Smad 通路中蛋白表达的影响（±s，n=12）Tab.6 Effect of BMSCs on protein expressions of TGF-β1/Smad pathway in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Smad 0.91±0.09 3.06±0.281）1.67±0.162）113.994 0.000 Groups Control Model BMSCs FP TGF-β1 0.86±0.08 3.45±0.331）1.62±0.152）124.715 0.000

图5 Western blot检测BMSCs对肝纤维化模型大鼠TGF-β1/Smad通路中蛋白表达的影响Fig.5 Western blot detection of effect of BMSCs on pro⁃tein expressions of TGF-β1/Smad pathway in liver fibrosis model rats

2.9 BMSCs对肝纤维化模型大鼠Th17/Treg水平的影响 模型组大鼠Th17 水平和Th17/Treg 显著高于对照组，Treg水平显著低于对照组（P<0.05）。BMSCs组Th17水平和Th17/Treg显著低于模型组，Treg水平显著高于模型组（P<0.05，图6、表7）。

表7 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠Th17 细胞、Treg 水平的影响（±s，n=12）Tab.7 Effect of BMSCs on Th17 cells and Treg levels in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

表7 BMSCs 对肝纤维化模型大鼠Th17 细胞、Treg 水平的影响（±s，n=12）Tab.7 Effect of BMSCs on Th17 cells and Treg levels in liver fibrosis model rats（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Th17/Treg 0.19±0.02 1.50±0.101）0.39±0.032）97.390 0.000 Groups Control Model BMSCs FP Th17/%0.95±0.07 3.84±0.271）1.66±0.112）74.785 0.000 Treg/%5.12±0.40 2.56±0.191）4.21±0.352）62.637 0.000

图6 流式细胞术检测BMSCs 对肝纤维化模型大鼠Th17细胞、Treg水平的影响Fig.6 Flow cytometry to detect effect of BMSCs on Th17 cells and Treg levels in liver fibrosis model rats

2.10 BMSCs对外周血淋巴细胞TGF-β1/Smad通路的影响 模型组大鼠单个核细胞中TGF-β1和Smad蛋白水平显著高于对照组（P<0.05），BMSCs 组单个核细胞中TGF-β1 和Smad 蛋白显著低于模型组（P<0.05，图7、表8）。

表8 BMSCs 对外周血淋巴细胞中TGF-β1/Smad 通路的影响（±s，n=12）Tab.8 Effect of BMSCs on TGF-β1/Smad pathway in pe⁃ripheral blood lymphocytes（±s，n=12）

表8 BMSCs 对外周血淋巴细胞中TGF-β1/Smad 通路的影响（±s，n=12）Tab.8 Effect of BMSCs on TGF-β1/Smad pathway in pe⁃ripheral blood lymphocytes（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Smad 0.87±0.09 3.04±0.281）1.75±0.162）158.406 0.000 Groups Control Model BMSCs F P TGF-β1 0.53±0.06 2.79±0.251）1.27±0.112）163.786 0.000

图7 Western blot 检测BMSCs 对外周血淋巴细胞TGF-β1/Smad通路的影响Fig.7 Western blot detection of effect of BMSCs on TGF-β1/Smad pathway in peripheral blood lymphocytes

3 讨论

肝纤维化是持续性和慢性肝损伤的结果，肝纤维化过程中，肝细胞凋亡，内皮屏障受损，炎症细胞被募集，肝星状细胞被激活，从而导致细胞外基质合成和降解失调，最终导致肝功能衰竭［10-11］。肝纤维化发病机制尚不清楚，研究认为病毒性肝炎、酒精、药物、代谢性疾病和自身免疫性疾病均可能引起慢性肝损伤导致肝纤维化，肝纤维化若得不到控制会发展为肝硬化甚至肝衰竭，严重影响患者生活质量和生命健康，但目前尚无可用于治疗肝纤维化的特异性有效疗法［12］。寻找可有效缓解肝纤维化的方法具有重要临床意义。

BMSCs 具有归巢效应，当组织损伤时，机体中的干细胞会向损伤部位迁移并分泌各种因子保护组织损伤，研究显示BMSCs 移植可有效缓解肝衰竭，保护肝功能［13］。近年研究发现BMSCs 对组织纤维化也具有缓解作用，如肺纤维化［14］。肝纤维化中，BMSCs 也具有缓解作用，但其效果和作用机制尚不明确。本研究显示，BMSCs 抑制可明显缓解肝组织损伤，抑制Col Ⅰ和Col Ⅲ转录和翻译，并抑制纤维化保护肝功能。此外，本研究显示，BMSCs 也可减少肝组织TGF-β1/Smad通路关键蛋白转录和翻译。TGF-β1是纤维化的最关键因子之一，其高表达会激活Smad 转录功能，从而促进Col Ⅰ和Col Ⅲ转录和翻译，导致肝纤维化［15］。王磊等［16］研究显示，BMSCs抑制可通过抑制肺组织TGF-β1/Smad信号通路缓解炎症反应，从而减轻大鼠急性肺损伤。胰腺炎大鼠模型中，BMSCs 也通过调控TGF-β1/Smad 信号通路缓解胰腺组织损伤［17］。BMSCs 也会通过外泌体抑制TGF-β1/Smad 途径诱导子宫内膜修复［18］。提示四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠模型中，BMSCs可能通过抑制肝组织中TGF-β1/Smad通路从而抑制Col转录和翻译，进而缓解肝纤维化，保护肝功能。

近年研究显示免疫炎症反应在肝纤维化进程中发挥重要作用，肝纤维化病理过程中，Th17 细胞比例升高，诱导巨噬细胞、中性粒细胞等活化诱发炎症反应，并可通过诱导IL-6和TGF-β1表达促进纤维化［19］。Treg 可拮抗Th17 细胞功能，分泌抗炎因子IL-4 和IL-10 等，从而抑制纤维化［20］。本研究显示，BMSCs移植不仅可诱导Th17/Treg平衡向Treg偏移，还可抑制淋巴细胞TGF-β1/Smad通路。王凯等［21］研究显示，BMSCs对不同淋巴细胞的影响不同，BMSCs可抑制Th17 细胞增殖并诱导Treg 增殖。BMSCs 可通过分泌鞘氨醇1 调节再生障碍性贫血患者Treg/Th17平衡［22］。也有研究显示BMSCs通过调节TGF-β相关通路上调Treg水平并下调Th17细胞水平，从而缓解系统性红斑狼疮［23］。

综上所述，BMSCs 可能通过抑制TGF-β1/Smad通路减少肝组织中Col 表达，并诱导Th17/Treg 向Treg 偏移，从而缓解肝纤维化。但BMSCs 抑制肝纤维化的疗效仍需临床研究，其作用机制需进一步探究。