红景天苷调节CLP诱导的脓毒症小鼠肺纤维化及JAK2/STAT3的活化①

虢 强 朱美意 张 杰 许 杰 郭友祥 （石河子大学医学院第一附属医院急诊外科，石河子 832008）

脓毒症是指由感染引起的全身性炎症反应综合征，常见于严重创伤、多发伤和外科手术后的患者，按严重程度可分为脓毒症、严重脓毒症和脓毒症休克。据国外流行病学调查显示，全球脓毒症病死率高达30%～70%，由于脓毒症治疗费用昂贵，医疗资源消耗大，严重影响人类生命健康和生活质量［1-3］。目前，临床上针对脓毒症的治疗方法主要有液体复苏和抗生素治疗等［4］。研究表明，脓毒症发病机制与全身性炎症反应、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤及外来感染源相关，与多系统、多器官的病理生理改变紧密联系，而肺脏是脓毒症并发症中损伤最严重的器官之一，脓毒症发生时，大量炎症因子和炎症介质的释放和活化，导致机体抗炎和促炎因子失衡，免疫功能受损，从而促进急性肺损伤的发生发展过程［5-6］。红景天苷是红景天根的活性成分，具有抗衰老、抗炎、免疫调节和抗氧化等药理作用。本实验旨在通过盲肠结扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）诱导脓毒症小鼠模型，探究红景天苷对脓毒症小鼠肺纤维化、炎症和JAK2/STAT3磷酸化的影响，为红景天苷在脓毒症中的临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物、试剂及仪器 红景天苷（纯度≥98%）购自四川维克奇生物科技有限公司（CAS10338-51-9）；HE试剂盒、Masson试剂盒和ELISA试剂盒均购自美国Sigma 公司；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、波形蛋白（Vimentin）、Ⅰ型胶原蛋白（Col Ⅰ）、IL-4、IL-6、IL-10、JAK2、STAT3和GAPDH兔单克隆单体及HRP标记的对应二抗均购自美国Abcam 公司。动物肺功能检测仪（上海塔望智能科技有限公司，PFT-MR）；光学显微镜（日本尼康，Eclipse E100）；脱色摇床（Servicebio，TSY-B）；掌上离心机（Servicebio，MX-F）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，RM2016）；组织摊片机（浙江金华市科迪仪器设备有限公司）；移液 枪（Dragon，KE0003087/KA0056573）；酶 标 仪（Rayto，RT-6100）；台式高速离心机（DRAGONLAB，D3024R）。

1.1.2 动物分组、建模及给药 50只清洁级BALB/c小鼠（雄雌不限，体质量20～25 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0011，使用许可证号：SYXK（京）2017-0033。动物饲养条件：每只小鼠给予24 h 昼夜灯光照射控制及严格、规范的卡片登记管理，24 ℃条件下独立饲养，建模前24 h 小鼠禁食不禁水。将小鼠分为健康对照组、模型组、模型+5 mg/kg红景天苷组、模型+10 mg/kg 红景天苷组、模型+20 mg/kg 红景天苷组（n=10）。模型加药组小鼠参照文献［7］分别腹腔注射5、10、20 mg/kg 红景天苷，1 h 后模型组和模型加药组小鼠参照文献［8］采用CLP 建立脓毒症急性肺损伤小鼠模型，腹腔注射10%水合氯醛（20 mg/kg）麻醉小鼠，腹部消毒后正中开腹，丝线结扎盲肠的根部，用无菌丝线结扎盲肠远端1.5～1.8 cm 处，用18 号无菌针头在已经结扎的盲肠远端中央处贯通穿刺，挤出少量内容物后将盲肠原位推回至腹腔并缝合切口，健康对照组只开腹、关腹并复苏，不进行CLP。术后10 h取血并处死大鼠，收集小鼠肺组织，组织清洗后部分组织置于4%多聚甲醛中固定用于染色实验，剩余组织置于液氮中保存用于分子实验。

1.2 方法

1.2.1 肺功能检测 取4%多聚甲醛固定的肺组织，按试剂盒说明书进行HE 染色。石蜡包埋组织并切片，组织切片厚4 μm，将切片清洗后浸入二甲苯和不同浓度梯度的乙醇溶液中30 min，用无水乙醇脱水处理。然后进行苏木精-伊红染色，最后用二甲苯和乙醇进行透明，中性树脂封片，随机选取10个视野在显微镜下观察拍照，并记录组织病理变化。胞核呈蓝紫色，胞质呈红色。参照文献［9］对各组小鼠进行肺组织损伤评分，评分标准包括间质水肿、肺泡水肿、炎症细胞浸润、肺泡出血和肺泡结果完整性破坏等项目，0分：无肺损伤；0.25～2.5分；轻度或中度肺损伤：2.6～4 分：严重肺损伤，40 倍显微镜下，每组随机选取10 个视野进行肺损伤评分，结果取平均值，肺损伤评分越高表示损伤程度越严重。采用干湿重法测定各组小鼠肺组织湿干重比值（W/D），取小鼠右肺下叶用4%多聚甲醛固定后称取湿重，然后置于70 ℃烘箱中烘干72 h 后称取干重，计算肺组织W/D，利用动物肺功能检测仪检测各组小鼠肺静息通气量。

1.2.2 Masson 染色观察肺纤维化 取4%多聚甲醛固定的肺组织，石蜡包埋组织并切片，脱蜡水洗处理步骤同1.2.1，经Masson染色后，用二甲苯和无水乙醇透明，中性树脂封片，于显微镜下观察拍照并记录分析，胞质、肌纤维、红细胞和纤维素呈橙红色，胞核呈蓝褐色，胶原纤维被染成蓝色。

1.2.3 Western blot 检测蛋白表达水平 液氮中取出肺组织，自然解冻后用手术剪将组织剪成组织小块并置于研磨仪中研磨均匀。采用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取组织总蛋白，4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min 后取上清，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白总浓度，每孔上样20 μg，经SDS-PAGE 电泳分离、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入一抗（1∶500），4 ℃摇床孵育过夜，次日回收一抗，加入HRP标记的二抗（1∶10 000），室温下摇床孵育2 h 后，采用ECL化学发光试剂于暗室下曝光显影。将胶片整理去色并存档，分别与GAPDH 蛋白灰度值比值计算蛋白的相对表达量。独立重复实验3次取平均值。

1.2.4 ELISA检测炎症因子含量 严格按照ELISA试剂盒说明书操作测定外周血中iNOS、IL-4、IL-6、IL-10含量。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0 软件分析，正态分布的计量资料表示为±s。多组数据比较采用方差分析，两两比较采用LSD 法，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天苷对脓毒症小鼠肺功能的影响 HE染色观察各组小鼠肺组织病理损伤程度，健康对照组小鼠肺组织结构正常，肺泡腔清晰可见，肺泡间间隔无水肿和炎症浸润。与健康对照组相比，模型组小鼠肺组织结构紊乱，无完整的肺泡结构，可见大量炎症细胞浸润。与模型组相比，5 mg/kg红景天苷组小鼠肺组织结构无明显变化，10 mg/kg 和20 mg/kg 红景天苷组小鼠肺组织结构趋于正常，可见完整的肺泡结构，肺泡间质仅见少量炎症细胞浸润。显微镜下随机选取10 个视野对各组小鼠进行肺组织病理损伤评分，结果取平均值，同时检测肺功能指标水平，与健康对照组相比，模型组小鼠肺损伤评分、肺组织W/D 显著升高，肺静息通气量显著减少（P<0.05）。与模型组相比，5 mg/kg红景天苷组小鼠肺损伤评分、肺组织W/D 和肺静息通气量差异均无统计学意义（P>0.05），10 mg/kg 和20 mg/kg红景天苷组小鼠肺损伤评分和肺组织W/D 降低，肺静息通气量增多，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1。提示红景天苷能够改善CLP 诱导的脓毒症小鼠肺组织病理损伤。

图1 各组小鼠肺组织HE染色及肺功能检测（HE，×400）Fig.1 HE staining and pulmonary function test of lung tissue of mice in each group（HE，×400）

2.2 红景天苷对脓毒症小鼠肺组织纤维化的影响 如图2所示，健康对照组小鼠肺组织结构完整，未见蓝色的胶原纤维。与健康对照组相比，模型组小鼠肺组织结构紊乱，可见大量蓝色胶原纤维和组织损伤。与模型组相比，5 mg/kg红景天苷组小鼠肺组织纤维化程度无明显差异，10 mg/kg 和20 mg/kg红景天苷组小鼠肺组织结构完整，可见少量的蓝色胶原纤维。提示红景天苷可减轻CLP 诱导的脓毒症小鼠肺组织纤维化。

图2 小鼠肺组织Masson染色图（×400）Fig.2 Masson staining image of mice lung tissue（×400）

2.3 红景天苷对脓毒症小鼠肺组织纤维化蛋白水平的影响 与健康对照组相比，模型组小鼠肺组织中α-SMA、FN、Vimentin、ColⅠ蛋白水平均显著上调（P<0.05）。与模型组相比，5 mg/kg红景天苷组小鼠肺组织中α-SMA、FN、Vimentin 和ColⅠ蛋白水平差异均无统计学意义（P>0.05），10 mg/kg和20 mg/kg红景天苷组小鼠肺组织中α-SMA、FN、Vimentin 和ColⅠ蛋白水平均显著下调（P<0.05），见图3。提示红景天苷能够抑制CLP 诱导的脓毒症小鼠肺组织纤维化。

图3 小鼠肺组织纤维标志蛋白表达水平Fig.3 Expression levels of fibrous marker proteins in mice lung tissue

2.4 红景天苷对脓毒症小鼠炎症因子含量的影响 与健康对照组相比，模型组小鼠肺组织中诱导型iNOS、IL-6、IL-4 和IL-10 含量均显著升高（P<0.05）。与模型组相比，5 mg/kg红景天苷组小鼠炎症因子水平差异无统计学意义（P>0.05），10 mg/kg 和20 mg/kg红景天苷组小鼠肺组织中iNOS、IL-6 水平显著降低，IL-4 和IL-10 水平显著升高（P<0.05），见图4。提示红景天苷可能通过调节CLP 诱导的脓毒症小鼠肺组织炎症因子水平缓解肺损伤。

图4 小鼠肺组织炎症因子水平Fig.4 Levels of inflammatory factors in mice lung tissue

2.5 红景天苷对脓毒症小鼠肺组织JAK2和STAT3磷酸化的影响 如图5所示，与健康对照组相比，模型组小鼠肺组织中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平显著上调（P<0.05）。与模型组相比，5 mg/kg红景天苷组小鼠肺组织中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平差异均无统计学意义（P>0.05），10 mg/kg 和20 mg/kg 红景天苷组小鼠肺组织中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平均显著下调（P<0.05）。提示红景天苷可能通过JAK2/STAT3 信号通路调节CLP 诱导的脓毒症小鼠肺纤维化和炎症。

图5 小鼠肺组织p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平Fig.5 Protein expression levels of p-JAK2 and p-STAT3 in mice lung tissue

3 讨论

研究表明，红景天苷在急性肺损伤中具有保护作用，如红景天苷通过上调SIRT1 表达抑制NF-κB和HMGB1 通路的活化，缓解CLP 诱导的脓毒症小鼠急性肺损伤和炎症反应［10］。红景天苷通过调节肺上皮细胞中miRNA-146 外泌体的分泌抑制脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠炎症反应，还可通过抑制NF-κB 磷酸化保护急性肺损伤大鼠肺损伤等［11-12］。本研究结果显示，经红景天苷给药治疗后，CLP诱导的脓毒症小鼠肺损伤得到显著改善，肺功能明显好转。提示红景天苷在脓毒症小鼠肺损伤中具有保护作用。

肺纤维化是指成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴随炎症损伤、组织结构破坏等的一系列病理变化［13-14］。α-SMA 是肌成纤维细胞增殖、分化及胶原蛋白形成的标志蛋白。FN 是细胞外基质糖蛋白成分，是成纤维细胞的活化因子，与肺纤维化密切相关。Vimentin 是中间丝中的一种蛋白质，为微管和肌动蛋白提供弹性，是维持细胞骨架完整性的重要蛋白。ColⅠ是上皮细胞活化、胶原酶形成及骨结构完整性的胶原蛋白。张翠影等［15］发现，α-SMA、FN、ColⅠ在急性肺损伤小鼠肺组织中的高表达与肺纤维化和肺损伤呈正相关。本实验结果显示，经红景天苷治疗后，脓毒症小鼠肺纤维化程度明显改善，α-SMA、FN、Vimentin和ColⅠ蛋白表达水平显著降低，且20 mg/kg红景天苷治疗效果最佳，此结果与张翠影等［15］的研究结果相符，说明红景天苷对CLP 诱导的脓毒症小鼠肺纤维化具有抑制作用。

肺部炎症和免疫功能障碍是脓毒症小鼠肺功能损伤的主要因素，脓毒症发生时，炎症因子和免疫因子大量释放，导致肺组织发生免疫失调和过度炎症反应，从而发生急性肺损伤［16］。iNOS、IL-4、IL-6、IL-10 是重要的炎症和免疫调节因子，iNOS 和IL-6在炎症反应中促进炎症发生，而IL-4和IL-10是炎症和免疫抑制因子［17-19］。本研究结果显示，经红景天苷给药治疗后，脓毒症小鼠肺组织中iNOS、IL-6 含量显著降低，IL-4 和IL-10 含量显著升高，结果提示红景天苷通过调节CLP 诱导的脓毒症小鼠肺组织中炎症因子水平缓解小鼠肺损伤。

为进一步明确红景天苷调节脓毒症小鼠肺组织纤维化和炎症的作用机制，课题组检测了JAK2和STAT3的磷酸化水平，JAK2是非受体型酪氨酸蛋白激酶家族成员，STAT3 是信号传导和转录激活因子，JAK2/STAT3 信号通路在细胞增殖、分化和免疫调节等生物学过程中发挥重要作用［20］。当机体受外界炎症因子刺激时，胞外信号蛋白与膜上受体结合并激活JAK2，活化的JAK2 使受体多位点酪氨酸残基磷酸化，吸引STAT3 与受体结合并磷酸化，磷酸化的JAK2诱导p-STAT3二聚体化或异二聚体化，并从复合物上脱离易位至细胞核内，与相应的反应元件结合，最后介导目的基因和炎症因子的表达，炎症因子又激活JAK2/STAT3 通路加重机体组织损伤［21］。王国全等［22］发现，脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织中高表达JAK2 和STAT3，本实验结果显示，CLP 诱导的脓毒症小鼠肺组织中高表达p-JAK2 和p-STAT3，经红景天苷治疗后，脓毒症小鼠肺组织中p-JAK2 和p-STAT3 表达水平显著降低。结合前期结果提示，红景天苷通过下调JAK2 和STAT3 表达抑制CLP诱导的脓毒症小鼠肺炎症反应。

综上所述，红景天苷对CLP 诱导的脓毒症小鼠肺纤维化、炎症具有保护作用，其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。