应用毛细管电泳技术鉴定杂交稻豪两优729 种子纯度

李婧婧 丁 龙 夏金凤 黄 冠 方先勇 余洪根

（安徽国豪农业科技有限公司，合肥 230088）

近年来，两系杂交稻不断发展壮大，是继我国三系法杂交水稻后又一世界领先的原创性重大科技成果[1]。两系法育种具有不受细胞质和恢保关系制约、配组自由、能广泛利用遗传资源聚合优良性状的技术优势，为保障我国和世界粮食安全提供了新方法和新途径。两系法杂交水稻主要是利用光温敏不育材料的育性转化来实现的，所以易受光、温等环境条件的影响，在制种期间若遇异常天气则导致不育系育性转化，使其部分自交结实。此外，在制种生产时未能有效隔离则会造成串粉，在收获、加工、包装等环节疏忽则会造成种子机械混杂[2]。以上因素均会造成种子纯度降低，因此，在种子销售前必须对种子的纯度进行检测，以确保销售的种子纯度合格。

种子纯度是种子四大质量指标中重要的一项，纯度的高低直接影响新品种市场规模、种子企业及农民的经济效益。目前，种子纯度鉴定有3 种形式:正季鉴定、海南鉴定、分子标记鉴定。正季鉴定时间滞后，其结果出来后种子已经销售。海南鉴定因其特殊的气候条件，植株形态可能与正季不同。随着生物技术的发展，分子标记可以从DNA 水平上快速、准确地对种子纯度进行检测。SSR 标记因其鉴别能力强、稳定、多态性好、检测方便等优点，成为现在室内鉴定种子纯度应用最为广泛的分子标记[3]。利用SSR 标记进行检测的方法多为聚丙烯酰胺凝胶电泳法，此方法程序繁杂，耗时耗力且使用有毒试剂，污染实验室环境。随着检测技术的发展，毛细管电泳解决了这一问题，在大量分户样品的纯度检测中快速简便、安全可靠。

豪两优729 是安徽国豪农业科技有限公司自主选育的籼型两系杂交水稻品种，于2019 年10 月通过了国家农作物品种审定委员会审定（审定编号:国审稻20190109）。豪两优729 在长江中下游作一季中稻种植。2016 年区域试验、2017 年续试、2018 年生产试验均比对照丰两优四号增产，分别增产3.32%、4.57%、4.14%。经农业农村部稻米及制品质量监督检验测试中心（杭州）检测分析，米质达部颁NY/T 593—2013《食用稻谷品种品质》标准三级。豪两优729 被农业农村部认定为绿色水稻品种。

本研究以豪两优729 及其母本63-8S（安徽省农业科学院水稻研究所育成的水稻温敏核不育系）和父本R729（自主选育的恢复系）为试验材料，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法，对NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程 SSR 标记法》中推荐的48 对核心引物进行筛选，获得适合豪两优729 测纯的引物。利用毛细管电泳检测技术对豪两优729的分户样进行快速纯度检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料父本R729 标准样是由安徽国豪农业科技有限公司提供，母本63-8S 标准样是由安徽省农业科学院水稻研究所提供，豪两优729 杂交种的分户样共4 份，其中2 份来自江西省赣州市会昌县农户（张起新-1、张起新-2），另2 份分别来自江西省赣州市宁都县农户（曾辉）、江苏省盐城市阜宁县农户（唐守成）。SSR 引物采用NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程 SSR 标记法》附录C 中推荐的核心引物中的6对。试验在安徽农业大学国家重点实验室完成，所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取随机选取健康幼苗，分别取0.5～1.0cm 大小的叶片放入96 孔PCR 板中，每孔中加入40µL 0.25mol/L 的NaOH 溶液（NaOH 溶液应该浸没植物组织），盖上软胶盖，放置于100℃的水浴锅内，加热1min，取出后每孔加入60µL 0.17mol/L 的Tris-HCl 溶液，再置于水浴锅沸水中煮3min，水煮后的样品冷却后即可作为PCR 反应的模板，备用。

1.2.2 SSR 引物筛选采用6 对SSR 引物分别对豪两优729 杂交种子及其双亲进行多态性筛选。聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR 扩增产物进行检测，染色采用银染法。

1.2.3 PCR 扩增用筛选得到的SSR 引物分别对分户样的DNA 进行扩增。10μL PCR 反应体系:10×Buffer（含Mg2+），2mmol/L dNTPs，5U/µL Taq DNA 聚合酶，50ng/µL SSR 引物。反应程序:94℃预变性4min，1 个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共31 个循环；72℃延伸5min，1 个循环；4℃保存待用。

1.2.4 水稻种子纯度检测使用美国AATI 毛细管电泳仪（ZAG）对每个分户样的188 株种子苗的扩增产物进行检测。根据仪器使用说明，对PCR 产物进行处理。一次可以上机9 板PCR 产物，并实现不间断循环自动化检测。使用PROSize 2.0 分析软件对获取的数据进行分析，并计算水稻种子纯度。

种子纯度（%）=（检测种子总数-杂株种子数）/检测种子总数×100

2 结果与分析

2.1 SSR 引物筛选本试验从48 对引物中随机选取了6 对引物（RM253、RM278、RM336、RM331、RM289、RM316）进行多态性筛选，结果显示RM336的多态性最好，在母本中扩增的条带大小为191bp，在父本中扩增的条带大小为157bp，且在杂交种中呈现共显性（图1），可以用于豪两优729 杂交种子的纯度鉴定。RM336 的引物序列（5′→3′）如下。RM336F:CTTACAGAGAAACGGCATCG；RM336R:GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG。

图1 RM336 对豪两优729 及其双亲的扩增结果

2.2 分户样的毛细管电泳纯度鉴定结果选用SSR引物RM336 分别扩增4 份豪两优729 的分户样，每户取200 粒种子发芽，分别提取188 份叶片DNA 用于PCR 扩增，对PCR 产物进行毛细管电泳检测，并用PROSize 2.0 数据分析软件对获得的数据进行分析。若所获得的峰图为双峰且与RM336 引物在其父母本中筛选的峰值一致，则认定为杂交种；若所获得的峰图为双峰且只有1 个峰值与RM336 引物在父母本中的峰值一致，则认定为异交种；若所获得的峰图为双峰但双峰的峰值均与RM336 引物在父母本中的峰值不一致，则认定为杂株；若所获得的峰图为单峰且主峰大小与RM336 引物在父本或者母本中的一个主峰大小一致，则认定为自交种。部分鉴定结果如图2。4 个豪两优729 的分户样中，张起新-2 有2 粒异交种、2 粒自交种，其余3 个分户样中均仅有2 粒自交种，纯度分别为:98.9%、97.9%、98.9%、98.9%。

图2 豪两优729 及其父母本毛细管电泳纯度鉴定峰图

2.3 分户样的田间纯度鉴定结果每个分户样田间鉴定，分别在苗期、抽穗期等整个生育期进行观察，记录各分户样的杂株类型和杂株数。田间正季鉴定结果显示（表1），4 个豪两优729 分户样种子纯度结果分别为99.5%、98.5%、99.4%、99.0%，与毛细管电泳检测技术鉴定结果趋势一致，验证了毛细管电泳技术鉴定杂交稻纯度的可靠性。

表1 豪两优729 分户样的田间纯度调查结果

3 结论与讨论

不同水稻品种的SSR 分子纯度鉴定所使用的引物不同，所以在水稻种子纯度检测前要筛选出在杂交种的父母本之间存在多态性的SSR 引物。本试验在筛选能够用于豪两优729 杂交种纯度鉴定的SSR 引物时，基于成本考虑选用了聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法。聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法无需昂贵的试验仪器，且试剂耗材成本较低，对试验人员的要求也较低，一般操作工在经过培训后即可进行，在分析少量的材料时经济适用，所以在SSR 标记筛选时宜选择此种方法。

在进行大量材料分析时，毛细管电泳检测技术的优势就显而易见了。首先，毛细管电泳检测技术可以实现全程自动化，自动灌胶、上样、电泳、收集数据等，一轮上样可以检测9 板PCR 产物，且24h 不停运转，中间无需人员操作，省时省力，将操作者从低效率、大强度的工作中释放出来，大大提高了工作效率，且避免了操作中的人为误差，增强了试验结果的可重复性和稳定性[4]。其次，毛细管电泳检测技术不需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中的甲醛、甲叉丙烯酰胺等有毒有害化学试剂，不仅对人体无害，而且对环境特别友好，有效保障了实验室环境的安全卫生。最后，因在上样前，PCR 产物各孔中均加入了分子量内标，各泳道的产物大小直接与其内标比较，毛细管电泳检测技术的检测结果更加准确。而聚丙烯酰胺凝胶不可能在每个泳道中点入分子量标准，只能用肉眼与分子量标准比较估测得出，远离分子量标准泳道的数据准确性难免会受到人为因素影响。

种子企业在大量制种时，通常委托多家制种企业，收到大量的分户样。种子企业要对各分户样进行质量检测，以确保入库的种子质量符合国家标准。大量分户样的纯度检测耗时耗力，采用一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，一般从收获到年关，2 个人每天都在做此项工作。而采用自动化程度较高的毛细管电泳检测技术，只需要1 人即可提前完成。这也关系到生产商是否能够及时拿到种子生产款，所以快速准确地进行分户样质量检测很有必要。在不考虑仪器成本的前提下，对大量样品的分析，毛细管电泳检测技术与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法的费用基本持平[5]，但毛细管电泳检测技术的效率以及环境安全性明显较高，所以在大规模材料分析时，选择用毛细管电泳检测技术来完成，更加高效精准。