SSR 标记荧光毛细管电泳在种子检测中常见问题分析

李巧英

（山西省种业发展中心，太原 030006）

分子标记技术是近年来发展较快的基因检测技术，随着新标记方法的开发和试验技术的改进，在基因水平上检测农作物种子信息逐渐成为监控种子质量的一个重要手段。由于分子标记法不受自然条件和表现性状的约束，实现了种子品种遗传信息室内快速检测，受到大家的青睐。SSR 作为第2 代分子标记方法，是一种共显性标记，具有重复性好、等位变异多、数据分析简便、易操作等优点，在农作物种子质量检测中被广泛使用。

荧光毛细管电泳技术将荧光检测的高灵敏度和毛细管电泳的高效性结合，利用电泳和电渗流的电动力学原理，在毛细管中灌满胶分离PCR 产物，检测荧光信号，数据软件分析系统将其转化成峰图，显示试验结果。该技术自动化程度高，检测通量高，试验操作简单，数据统计程序化，避免人为估算的主观性，结果精确到1bp[1]，直接显示扩增产物片段的大小，实现了指纹图谱与碱基序列长短之间的对应转换，易于实验室间结果比对，常用GeneMapper和GeneMarker 分析SSR 扩增片段[2]。本文就试验中遇到的荧光信号强度、特异峰型的统计分析以及毛细管电泳仪运行和维护、试验结果与数据库比对等问题进行分析，为SSR 分子标记荧光毛细管电泳检测农作物种子质量试验技术标准化提供参考。

1 均一荧光信号采集的保证

SSR 分子标记荧光毛细管电泳采集荧光信号作为试验数据的基础，严格要求模板DNA 浓度和扩增体系的配置比例，避免不同样品孔间荧光信号强弱差异大带来干扰。扩增前将模板DNA 原液稀释至浓度一致；扩增体系按照引物、模板、酶最佳配比设置。优质的DNA 和完美的扩增体系结合可以打造一套高质量的品种信息指纹图谱，获得准确可靠的试验数据。

电泳过程中，为确保采集到的荧光信号真实可信，要求扩增板每个样品孔内PCR 产物独立有效，封口的膜和封膜技术是关键。封板膜要求均匀透光，有一定的韧性，电泳仪能清晰获取荧光信号，且膜将样品孔密封，形成互不干扰的PCR 微循环环境。通常采用热封或激光封膜，防止PCR 产物蒸发损失和样品间的交叉污染，保证PCR 产物的独特属性和检测结果准确有效。

2 特异峰型的统计分析规律

电泳结束，分析软件将检测结果绘制成峰图展示出来，统计分析各位点的特异峰，自动过滤非特异峰。理想的特异峰（图1a 左）为独立的单峰，峰型尖锐锋利，周围有若干小峰；非特异峰（图1a 右）偏矮胖，峰较低，不作统计。实际检测中会遇到不同的峰型，有连续峰（图1b）、高低峰（图1c）、n+1 峰（图1d）、多峰（图1e，f）、pull-up 峰[2-3]等情况。连续峰（图1b）多由几个相差2bp 的峰群组成，以较高的峰或最右边的峰大小为试验结果，统计为单峰，避免识别为多峰；遇到高低峰（图1c）时，通常读取较高峰的数值，或比对数据库中参照样品峰型的统计规律；n+1 峰（图1d）在试验中比较常见，即同一位置出现2 个峰，相差1bp，作为单峰计算，识别较高峰的数值；多峰（图1e，f）在混样检测时出现，首先要确定是由于样品混杂引起的多峰，还是此品种在该位点的特异属性，需要采用单粒提取DNA，重新扩增，证实多峰的属性，当多峰为特异峰时识别最高的峰。pull-up 峰是一种干扰峰，在多重荧光电泳时，由于某色荧光引物的特异峰在某个位置较高，把这个位置其他色荧光引物的峰连带升高而产生，统计分析时剔除。

图1 荧光毛细管电泳峰图类型

3 数据统计与指纹数据库比对

数据统计时，先分析分子量内标（LIZ）、参照样品和空白对照的峰型，LIZ 峰型准确，参照样品数据与指纹数据库一致，空白对照中无明显的特异峰，则表明试验准确，数据可采纳。试验中可选择合适的LIZ，用LIZ校正等位基因峰值，SSR分子标记属于短串联重复，DNA 片段较短，如玉米种子真实性检测SSR 分子标记等位基因位于100～430bp 之间[4]，可选用LIZ500 作为分子量对照。参照样品一般选择常见的指纹稳定且具有特异峰型的品种，设置参照样品用于校正不同试验批次的指纹数据，提取有效峰值并将数据整合标准化。空白对照用于检测试剂耗材和试验环境是否被污染，以确定试验结果的可靠性。

试验数据与指纹数据库比对时，需要比较特异峰的位置及峰型。参照样品的峰图与指纹数据库中的数据吻合，待测样品与参照样品采用统一的读数规则计数，数据整理后，上传指纹数据库比对[5]。同名品种比较，确认待测样品品种的真实性；与全库品种比较，识别待测样品的身份，比对过程中，个别差异位点需要人工确认。

4 毛细管电泳仪的运行与维护

毛细管电泳仪的运行环境温度适宜保持在24±2℃，室温太高毛细管内温度升高，会使溶液黏度下降，电渗速度增大；室温太低，加温炉升温慢，影响电泳速率和分离效果，适宜的检测温度可保证试验结果的准确性。电极槽倒入缓冲液，两极插入缓冲液中，电泳通路保持湿润，如果干燥，会导致毛细管堵塞，影响电泳。仪器运行时各级连接口密封，避免进入空气，气泡会阻断电流，产生放电，损坏密闭的电泳通路，如有气泡，用凝胶把系统中的气泡排出。进样前经专用洗液清洗毛细管和连接管路，保证电泳通道畅通。正式电泳时，毛细管进口端连接凝胶，用新胶灌注毛细管，暂时不用时可以用清洗液浸没凝胶入口。

5 小结

SSR 分子标记荧光毛细管电泳检测方法在农作物种子质量检测中的应用实现了快速高效检测，数据统计标准化、规范化，解放了人力，减少了人员误差，并且试验结果准确，精确度高[6]，可以单独检测待测样品，结果与数据库比对。综上所述，解决好试验中遇到的问题，能够大大提高检测效率，适应当前种子市场管理的需要，为农作物种子质量监测提供一个可靠的检测平台。