转基因抗虫棉种子室内筛选

张 文 刘铨义 冯 杨 逯 涛 王国平 王海娟

（新疆生产建设兵团第七师农业科学研究所，奎屯 833200）

棉花是一种重要的天然植物纤维，也是重要的经济作物。我国是世界上生产、消费与进口棉花最多的国家[1]，因此棉花在我国农业生产中占据十分重要的地位。近些年来，由于气候条件、生态环境、耕作制度以及种植业结构的改变，农业害虫抗药性不断增加，棉田害虫为害特别是棉铃虫的为害日益严重，棉铃虫种群数量总体上呈增加趋势[2]。化学防治是抑制棉铃虫为害的重要手段，虽然该种方法抑制效果好，但会对环境造成严重污染，更关键的是长期使用化学杀虫剂极易使棉铃虫产生抗药性，导致实际生产中化学防治效果甚微[3-4]。随着科技的不断发展，我国开始推广种植转基因抗虫棉，由于其能很好地控制棉铃虫的发生，种植区域不断扩大，到2017 年全国转基因抗虫棉的种植面积约280 万hm2[5]。

转基因抗虫棉是推动我国棉花产业快速发展的重要举措，建立一种简单、方便、快速的转基因棉花检测与鉴定方法是促进其发展的关键[6]。卡那霉素抗性基因是目前植物遗传转化中应用最早和最广泛的一种选择标记基因，通过阻断非转化植株叶绿体蛋白质的合成，促使植株白化来达到鉴定与筛选的目的。李雪林等[7]发现利用卡那霉素溶液浸种萌发法可更加简便、大量、快速地鉴定与筛选出转基因棉花植株。赵俊侠等[8]研究发现将棉种浸泡于150mg/L 卡那霉素中，2～4d 后根据种子萌发长度可进行转基因抗虫棉的筛选。吕孟雨等[9]研究认为采用卡那霉素溶液浸种是一种经济有效且准确可行的筛选含有npt-II 基因的转基因棉花材料的方法。也有学者研究发现，田间卡那霉素筛选是一种快捷的棉花转基因鉴定与筛选方法，但可靠性低，准确率只有20%[10]。此外，田间一株一叶涂抹不仅工作量繁重，也极易受天气环境和人为操作的影响，从而造成鉴定结果假阳性偏多[11]。PCR 技术也是最主要的转基因检测技术之一[12]，但PCR 法较复杂，不但需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员，且耗时较久，抽样量、抽样面积小也易导致漏检，不适合大规模筛查和现场即时检测。随着科学技术的发展，转基因试纸条技术应运而生。宁新民等[13]提出，试纸条检测法是一种十分有效的外源抗虫基因检测手段。张欣等[14]采用转基因试纸条法与荧光定量PCR 法对大批量稻谷和大米样品进行检测，2 种方法检测结果基本一致。Mutoni 等[15]用试纸条法和PCR 法检测了115 份玉米样品，结果显示PCR 法与蛋白质试纸条法的检测结果完全一致。因此，本研究通过转基因试纸条法和卡那霉素室内浸种法，摸索出一种简单、方便、快速、准确的鉴定转基因棉花的方法来满足转基因种子的鉴定与筛选需要。

1 材料与方法

1.1 供试材料转基因抗虫棉材料为鲁棉研24 号母本和鲁棉研24 号父本，由北京中农金科种业科技有限公司提供；非转基因材料为国审棉Z1112 和新审棉Z1146，由新疆生产建设兵团第七师农业科学研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 转基因试纸条检测法选用浙江托普云农科技股份有限公司（灵敏度1%）、上海佑隆生物科技有限公司（灵敏度1%）和奥创生物技术（山东）有限公司（灵敏度2ng/mL）生产的转基因试纸条进行转基因检测。将20 粒种子磨碎至粉末状后，按照说明书的步骤进行样本处理和检测，一般5～10min 可出结果。

阳性（有转基因）即在检测试条的检测区及质控区出现两条紫红色条带，即一条检测线和一条质控线。阴性（无转基因）表现为仅在检测试条的质控区出现一条紫红色质控线。

1.2.2 卡那霉素浸种法供试药剂为100 万单位（1g/mL）的硫酸卡那霉素注射液，由河北远征禾木药业有限公司生产。用蒸馏水将硫酸卡那霉素注射液分别配成0mg/L（蒸馏水）、2500mg/L、5000mg/L、7500mg/L 的溶液，将供试的4 种棉花种子各取60粒，3 个重复，分别浸泡在不同浓度的硫酸卡那霉素溶液中，放入28℃恒温发芽培养箱中浸种48h，然后进行沥干催芽8h，观察棉种发芽情况。将种子按照常规沙培发芽试验的方法播种，放入28℃恒温发芽培养箱中，于播种后10d 观察侧根生长情况。

1.3 数据分析采用WPS office 软件进行数据处理和制表。

2 结果与分析

2.1 转基因试纸条检测选用非转基因材料Z1112、Z1146 和转基因抗虫棉鲁棉研24 号父本、鲁棉研24 号母本为材料，用3 个品牌的Bt-CryI Ab/Ac 试纸条对其进行检测，结果（图1）显示3 个品牌的试纸条检测结果完全一致，均能快速、准确地检测出非转基因材料和转基因抗虫棉材料，且准确率达到100%，说明转基因试纸条法是一种简单、快捷、准确的转基因抗虫棉筛选方法。

图1 3 种转基因试纸条对不同棉花品种的检测结果

2.2 硫酸卡那霉素溶液浸种后的发芽情况由表1 可知，以不同浓度硫酸卡那霉素溶液处理的转基因抗虫棉种子（鲁棉研24 号父本和鲁棉研24 号母本）浸泡后发芽率均在90%（含）以上，而非转基因材料的种子（Z1112 和Z1146）发芽率随着硫酸卡那霉素溶液浓度的增大而大幅度降低，当硫酸卡那霉素溶液浓度在5000mg/L 时，发芽率分别为31.7%、53.3%，浓度升至7500mg/L 时，发芽率分别仅为16.7%、31.7%。

表1 硫酸卡那霉素对棉花种子发芽情况的影响

2.3 硫酸卡那霉素溶液浸种后侧根生长情况由图2 可知，培养10d 后，不同浓度硫酸卡那霉素溶液处理的转基因抗虫棉均有幼苗长出侧根，硫酸卡那霉素溶液浓度在5000mg/L 时，鲁棉研24 号父本和鲁棉研24 号母本分别有79.2%、72.4%的棉种有侧根长出，当硫酸卡那霉素溶液浓度达到7500mg/L时，仅有27.9%、46.0%的棉种有侧根长出。而非转基因材料随着硫酸卡那霉素溶液浓度的增加侧根长出比率急剧下降，当硫酸卡那霉素溶液浓度在5000mg/L 时，Z1112 和Z1146 仅有5.6%、9.7%的棉种有侧根长出，至7500mg/L 时，2份材料均无侧根长出。因此，用5000mg/L 的硫酸卡那霉素溶液浸种48h，并持续培养10d，可根据侧根发生情况有效筛选出转基因棉花。

图2 硫酸卡那霉素溶液处理对棉花侧根长出比率的影响

3 结论与讨论

对后代进行筛选和鉴定是转基因抗虫棉育种的首要工作，因此，建立一种快速、准确、成本低廉的转基因抗虫棉筛查方法十分必要。目前，关于转基因棉花的筛选已有许多报道，大多都是在田间利用卡那霉素溶液对叶片进行涂抹，这种方法不仅工作量大，而且受季节的局限[16]。针对上述情况，有学者开始在室内利用卡那霉素进行转基因植株的后代筛选，李雪林等[7]研究发现100mg/L 卡那霉素溶液能显著抑制非转基因棉种的萌发和下胚轴的伸长；经PCR 验证，筛选出的棉种阳性率达到95%以上。王彦霞等[16]提出了3 种可在室内快速筛选与鉴定转基因抗虫棉的方法，但都是基于叶片对卡那霉素溶液产生的黄化反应，而且试验的工作量也比较大。寇伟等[17]研究发现5000mg/L 卡那霉素溶液浸种后通过观察棉种的侧根生长情况可较为准确、快速地筛选出转基因棉花。孙锋等[6]研究认为将棉种浸泡在浓度为4000mg/kg 的卡那霉素溶液中48h 可快速筛选出转基因种子。本研究结果与上述结果基本类似，用5000mg/L 的硫酸卡那霉素溶液浸种48h，并持续培养10d，可有效筛选出转基因棉花。但也有学者认为利用卡那霉素浸种法筛选转基因种子受诸多因素影响，如:培养基质、药剂处理方式、卡那霉素浓度、溶液体积、种子数甚至籽粒的饱满程度、浸种时间、遗传背景等都会对筛选效果有很大影响[18]。

本研究还进行了转基因试纸条检测，结果显示3 个品牌的试纸条检测结果完全一致，均能快速、准确地检测出转基因抗虫棉材料，整个检测过程只需要10～15min，且不需要专业的技术人员，对实验的条件要求也不严格，而相对来说，卡那霉素浸种法的检测周期更长，而且存在试验误差，影响试验准确率。因此，转基因试纸条法是一种更为快速、准确的鉴定和筛选转基因抗虫棉植株的方法。随着转基因试纸条技术的不断成熟和发展，其有望在我国转基因植株筛选和鉴定方面发挥更大的作用。