外周血细胞参数对CD19-CART治疗难治/复发急性B淋巴细胞白血病疗效的预测作用

张战强 张改玲 苏云超 何九江 张 敏 杨君芳 张 弦

（北京陆道培医院血液科，北京，102600）

急性B 淋巴细胞白血病是由于前体B 细胞发生恶变、无限增殖而产生的疾病。其存在两个发病高峰，一个是幼年发病，一个是成年发病。幼年发病的急性B 淋巴细胞白血病预后较好，十岁以下儿童单纯化疗可达80%以上的治愈率，但仍有少部分患儿会出现复发或难治。而成人急性淋巴细胞白血病多为标危和高危患者，治疗效果差，多数患者会出现难治和复发。难治或复发急性B 淋巴细胞白血病（R/R B-ALL）对化疗反应差，随着嵌合抗原受体T 细胞（CAR-T）治疗技术的发展，CD19-嵌合型抗原受体T 细胞（CD19-CAR-T）可使R/R B-ALL 的完全缓解率达到70%～90%。在CAR-T 细胞治疗B-ALL 过程中，需要监测CAR-T 细胞比例和白血病微小残留病变（MRD）以明确CAR-T 治疗的效果。外周血细胞数值反映正常造血的状态，与骨髓白血病负荷相关，有可能反映CAR-T 细胞对白血病细胞的治疗效果。另外，与化疗不同，CAR-T 细胞不杀伤正常造血细胞，因而CAR-T 细胞治疗后正常造血的恢复可能快于化疗后的造血恢复。为研究上述两个问题，本文比较了CAR-T 治疗有效组与CAR-T 治疗无效组的外周血细胞数值，研究血细胞数值对CART 治疗效果的预测作用，进而探讨CAR-T 治疗对正常造血的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2017 年5 月～2020 年5 月北京陆道培医院应用CD19-CAR-T 治疗难治/复发急性B 淋巴细胞白血病患者的临床资料，比较治疗后46 例微小残留病阴性患者和38例微小残留病阳性患者治疗过程中的外周血细胞参数。MRD阳性组为CD19-CAR-T 治疗细胞治疗后第28 天骨髓检查微小残留病为阳性的患者。MRD 阴性组为随机选择的同期进行CD19-CAR-T 细胞治疗后第28 天骨髓检查微小残留病为阴性的患者。本研究为回顾性分析，符合2013 年修订的《赫尔辛基宣言》要求。

1.2 纳入排除标准

纳入标准：①所有患者均进行骨髓穿刺行细胞形态学、免疫细胞表型、细胞遗传学、融合基因和基因突变等检查，均符合急性B 淋巴细胞白血病的诊断标准；②均为难治/复发B-ALL，其中复发B-ALL 指完全缓解后复发，再化疗至少1 个疗程不能获得完全缓解，包括MRD、异基因造血干细胞移植后复发B-ALL，难治B-ALL 指初治B-ALL 患者至少两个疗程化疗未达到完全缓解；③所有患者ECOG 评分0～3 分。

排除标准：①总胆红素＞170 umol/L；②谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）＞200 umol/L；③血清肌酐清除率小于60 mL/min；④接受异基因造血干细胞移植后的急性B-淋巴细胞白血病患者患有急性移植物抗宿主病（aGVHD）≥2 级或者正在抗aGVHD 治疗，如环孢菌素-B、他克莫司、激素等；⑤CD19-CAR-T 细胞回输前6 周内接受过异体细胞治疗，如供体淋巴细胞回输、脐血来源的间充质干细胞治疗；⑥受试者接受最近一次抗肿瘤治疗（放化疗、单抗或激素）小于1 周；⑦严重中枢神经系统白血病（脑脊液中有肿瘤细胞，但＜15WBCs/mL 可以入组）；⑧颅内高压或意识不清；⑨呼吸衰竭；⑩弥漫性血管性内凝血；⑪纽约心脏病协会（NYHA）分级为Ⅲ级以上者。

1.3 方法

（1）首先采集患者外周血单个核细胞（PBMC），进行转染等处理产生CD19-CAR-T 细胞，体外培养11～14d 后回输。（2）回输前3～5 d 给予氟达拉滨/环磷酰胺方案预处理，具体用法：氟达拉滨30 mg/m，d1-3，环磷酰胺250 mg/m，d1-3。（3）CD19-CAR-T 细 胞 回 输 数 量（1～6）×10/kg。（4）回输后监测病情变化，及时处理细胞因子释放综合征（CRS）及CAR-T 细胞相关脑病综合征。当患者出现发热、低血压、低血氧和脏器毒性反应时，需考虑细胞因子释放综合征的诊断。细胞因子释放综合征的分级根据Lee 等对免疫反应所致CRS相关不良反应的评估标准进行评定。对于轻症患者可给予吸氧、补液、退热等对症处理，对于严重患者需及时给予抗白介素-6 抗体（托珠单抗）和激素治疗，必要时使用呼吸机等生命支持，以防止出现严重并发症。CAR-T 细胞相关脑病综合征的诊断从评估患者的神经功能、有无颅内压增高、有无癫痫发作或肢体无力三个方面开始，根据美国CAR-T 细胞治疗相关毒性（CAR-T-cell-therapy-associatedTOXicity，CARTOX）工作小组提出的针对CRES 的分级标准，将CRES分为1～4 级。通过CARTOX-10 评分（总分10 分，10 分为认知功能正常者）对患者的神经功能进行评估，具体包括询问患者年、月、城市、所在医院名称和国家领导人姓名（共5 分），命名三个对象：如时钟、笔和按钮（最多3 分）；写一个完整的句子，如“我的名字是XXX”（1 分）；从100 开始以10 为间隔倒数计数（1 分）。当出现严重CRES 反应时，需要给予地塞米松10 mg，4 次/d，必要时给予鞘内注射激素。

1.4 观察指标

（1）所有患者在CAR-T 细胞回输当天行骨髓细胞形态学检查及MRD 检测，然后回输CAR-T 细胞，所测数值定义为CD19-CAR-T 细胞回输前的骨髓原始细胞数及CD19-CAR-T 细胞回输前的MRD。（2）收集CAR-T 细胞回输当天，CAR-T 细胞回输后第7 天，第14 天，第21 天和第28 天的血常规、CART 细胞比例及细胞因子水平。（3）收集CD19-CAR-T 细胞回输后第28 天的骨髓细胞形态学及MRD 等疗效指标。血常规检测项目包括白细胞数值、血红蛋白数值、血小板数值、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比和单核细胞百分比。（4）疗效标准：CD19-CAR-T 细胞回输后第28 天的骨髓细胞MRD 小于10为CAR-T 治疗有效组，不满足上述标准为CAR-T 治疗无效组。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 两组患者的病例特点

两组患者在性别、年龄方面对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。CD19-CAR-T 治疗有效组骨髓原始细胞数和MRD 平均值远低于CD19-CAR-T 治疗无效组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组的CD19-CAR-T 细胞峰值和CRS 发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 两组患者的血常规

CD19-CAR-T 细胞回输当天外周血细胞数值：CD19-CAR-T 有效组（MRD 阴性组）的白细胞数、血红蛋白数值、血小板数值及中性粒细胞数值明显高于CD19-CAR-T 无效组（MRD 阳性组）的数值，两者对比差异有统计学意义（P＜0.05）。其他血细胞数值两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

CD19-CAR-T 细胞回输第7 天外周血细胞数值：CD19-CAR-T 有效组的平均血小板数值为91.46×10/L，明显高于CD19-CAR-T 无效组的平均血小板数值61.89×10/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。其他外周血细胞数值两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

CD19-CAR-T 细胞回输第14 天外周血细胞数值：CD19-CAR-T 有效组的平均血小板数值为135.92×10/L，明显高于CD19-CAR-T 无效组的平均血小板数值63.85×10/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。其他外周血细胞数值两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

CD19-CAR-T 细胞回输第21 天外周血细胞数值：CD19-CAR-T 有效组的平均血小板数值为89.56×10/L，明显高于CD19-CAR-T 无效组的平均血小板数值40.54×10/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。其他外周血细胞数值两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

CD19-CAR-T 细胞回输第28 天外周血细胞数值：两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

对白血病的免疫治疗，人类探索了100 多年，但疗效并不确切。正是由于嵌合型抗原受体T 细胞的出现才使免疫治疗从幕后走向了前台，显示出了确切的疗效。正常的T 细胞依靠表面的T 细胞受体识别肿瘤细胞，识别的方式是T 细胞受体识别并结合肿瘤细胞表面由主要组织相容性递呈的肿瘤抗原。但肿瘤细胞经常通过丧失主要组织相容性抗原，或者不递呈肿瘤抗原而防止被T 淋巴细胞受体识别和杀伤，进而达到免疫逃逸的目的。与T 细胞不同，B 细胞是通过表面的受体直接识别肿瘤表面标志，而无需主要组织相容性抗原的辅助，其识别抗原主要是抗体的可变区，正是基于这种思想，美国国立卫生研究院的Rosenberg 等首次通过病毒将识别抗原的抗体单链可变区基因导入到T 细胞，使其在T 细胞表面表达，而直接识别肿瘤表面的标志，称之为嵌合型抗原受体T 细胞，随后利用针对B 细胞表面标志CD19 的嵌合型抗原受体T（CD-19-CAR-T）细胞在复发难治的急性B 淋巴细胞白血病检测中取得了巨大成功。

急性淋巴细胞白血病复发难治的原因多为筛选出了复发难治的克隆，此克隆经常表现为多药耐药，导致挽救治疗完全缓解率很低，尤其是达到MRD 阴性的完全缓解率更低。复发难治的急性淋巴细胞白血病再次缓解后，只有进行异基因造血干细胞移植才能彻底治愈。而移植的成功率主要取决于是否达到完全缓解，尤其是MRD 阴性完全缓解。MRD 阴性的移植成功率明显高于MRD 阳性的患者。

CD19-CAR-T 细胞使难治复发急性B 淋巴细胞白血病达到MRD 阴性完全缓解方面具有明显的优势。因此，采用CD19-CAR-T 细胞治疗复发难治的急性B 淋巴细胞白血病达MRD 阴性后再行异基因干细胞移植，可使更多患者获得治愈的机会。CD19-CAR-T 细胞的疗效取决于CD19-CAR-T细胞在体内的扩增程度，以及CD19-CAR-T 细胞与肿瘤细胞的比例。所以需要监测CAR-T 细胞比例及白血病微小残留病变（MRD）以明确CAR-T 细胞治疗的效果，但需要流式细胞仪等设备，监测成本高且耗时。寻找可替代的方法可以促进CAR-T 细胞治疗技术的应用及降低费用。外周血细胞数值变化反映正常骨髓造血，而且有助于了解白血病细胞对正常造血的影响，有可能预示CD19-CAR-T 细胞的治疗效果，为此进行了该项研究。

在CD19-CAR-T 细胞回输当天，CD19-CAR-T 有效组患者白细胞、血红蛋白、血小板和中性粒细胞数明显高于CAR-T 有效组的数值，说明CAR-T 有效组初始肿瘤负荷低，对正常造血的抑制作用弱，这也与两组治疗前CAR-T 有效组CAR-T 前骨髓原始细胞数和MRD 低于CAR-T 无效组相一致，提示CD19-CAR-T 细胞回输当天骨髓抑制轻者易于达到MRD 阴性，因而CD19-CAR-T 细胞回输当天外周血细胞数值有可能做为CAR-T 细胞治疗效果的预测指标。

本研究中CD19-CAR-T 细胞回输后第7 天、第14 天和第21 天的平均血小板数值，在CD19-CAR-T 有效组明显高于CD19-CAR-T 无效组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示在CD19-CAR-T 有效组患者中，CD19-CART 细胞对白血病细胞清除速度快，正常造血功能恢复快速，表现为外周血小板数值的快速升高。因而CD19-CAR-T 细胞回输后第7天、第14 天和第21 天血小板数值有可能做为CAR-T 细胞治疗效果的预测指标。

急性淋巴细胞白血病化疗后血小板数值的上升，尤其是血小板的上升速度，反映了正常骨髓造血的恢复。而化疗后正常骨髓造血的恢复除取决于残留白血病细胞的抑制程度，还取决于化疗的抑制程度。所以血小板的恢复反映骨髓原始细胞的下降程度，与MRD 相一致，而且也与化疗的抑制程度相一致。研究显示血小板数值的恢复多在化疗后14～28 d。

本研究中CD19-CART 细胞治疗后第7 天，治疗有效组血小板即明显高于治疗无效组，明显早于化疗后14～28 d 血小板恢复的时间，提示CAR-T 细胞后的造血恢复早于化疗后的造血恢复。其原因可能在于化疗对白血病细胞和正常造血细胞均进行杀伤，与之不同，CD19-CAR-T 细胞治疗急性淋巴细胞白血病时，仅针对白血病细胞进行杀伤，正常造血细胞不受伤害，正常造血的恢复主要取决于骨髓中白血病细胞数量，所以恢复速度较快，表现为血小板的快速上升。

综上所述，外周血细胞参数对CD19-CAR-T 细胞的治疗效果具有预测作用。CD19-CAR-T 细胞回输当天白细胞、血红蛋白、血小板和中性粒细胞数值高者，CD19-CAR-T 细胞回输后第7 天、第14 天和第21 天血小板数值高者预示CART 细胞治疗效果好，因而血常规的变化可以用来预测CD19-CAR-T 细胞的疗效，同时提示CAR-T 细胞治疗后较化疗后正常造血恢复速度快。