海南白蚁共附生放线菌的分离鉴定及其抗热带作物病原真菌活性研究

吴炜城　陈必婷　张世清　郭志凯　李吉涛

摘  要：白蟻（Isoptera）的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行，所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此，白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系，放线菌是其中一个重要的类群，且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产物。但是白蚁共附生放线菌能否对热带作物的病原真菌有抑制活性有待研究。为了挖掘在热带农业绿色健康发展中具有应用潜力的海南特色农用放线菌资源，以海南白蚁共生放线菌为研究对象，利用平板分离法从采集的健康白蚁体内分离纯化放线菌，利用平板对峙法筛选生防菌株;通过分子生物学确定其分类地位;平板对峙法研究拮抗菌株的抗菌稳定性、持效性和广谱性;滤纸片法研究抑菌物质的热稳定性。结果从海南白蚁体内分离得到1株拮抗活性较好的放线菌菌株W7，系统发育树分析结果表明该放线菌与链霉菌属（）亲缘关系接近。菌株W7的抗菌活性持久性强，平板接种30 d后仍对植物病原真菌具有抑菌活性，抗菌稳定性好;菌株W7抑菌谱广，对16株植物病原真菌有不同程度的抑菌活性，其中对芒果胶孢霉（Penz.）、香蕉炭疽霉（）、辣椒棒孢霉（）、豇豆瓜果腐霉[ （Edson） Fitzp]抑制作用较强，对芦笋拟茎点霉（）、荔枝疫霉（）抑制作用较弱;菌株W7发酵粗提物有较好的热稳定性，但是抑菌率会随着水浴温度的增高而降低。本文首次对海南白蚁共附生放线菌进行了分离鉴定，并从中筛选得到1株具有抑制多种热带作物病原真菌活性的生防菌株，为高效生防菌剂的研发提供新资源。

关键词：白蚁;共附生放线菌;植物病原真菌;生防菌剂中图分类号：S476.1      文献标识码：A

Isolation and Identification of Symbiotic Actinomycetes from Termites in Hainan and Their Activity Against Tropical Plants Pathogenic Fungi

WU WeichengCHEN BitingZHANG ShiqingGUO ZhikaiLI Jitao

1. Hubei Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization （Hubei Minzu University）， Enshi， Hubei 445000， China; 2. Hainan Key Laboratory of Tropical Microbe Resources / Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Hainan Key Laboratory of Conservation and Utilization of Tropical Agricultural Bioresources / Hainan Institute of Tropical Agricultural Resources， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

The nesting and foraging activities of termites are mainly carried out in soil and rotting wood， where many pathogenic microorganisms live. However， termites are extremely vulnerable to these environmental pathogenic microorganisms. Therefore， termites need to rely on their mutualistic symbiotic microflora to form a defense system. Species of actinomycetes are one of the important groups in termite’s symbiotic microflora， which can produce diverse structures of secondary metabolites with antibacterial and antifungal activity. Whether the actinomycetes in termites can inhibit the pathogenic fungi of tropical crops remains to be studied. In order to explore the characteristic actinomycetes with potential application in the healthy development of tropical agriculture in Hainan， the actinomycetes were isolated and purified by the plate separation method from the healthy termites collected in the tropical plants garden of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences in Haikou. Biocontrol strains were screened against 16 species of plant pathogenic fungi including Penz.， ， ， ， ， ， ， Fetrak & Cif.， ， ， ， sp.， （Edson） Fitzp and by the growth plate-confrontation method. Identification of bioactive strain was based on the phylogenetic tree analysis constructed with 16S rRNA gene sequence. Growth plate-confrontation was directly used to investigate the antimicrobial stability， persistence and bacteriostatic spectrum for the strain and the filtering paper method was used to study the heat stability of antimicrobial substances for the crude extract of the bioactive strain. As a result， one strain of actinomycete （W7） with the best biocontrol activity was isolated from termites. Phylogenetic tree analysis showed that the strain W7 was closely related to genus. Most importantly， the bioactivity tests showed that the strain W7 had strong antifungal persistence and antifungal stability， even after cultivating for 30 d， it still had better antifungal against the tested plant pathogenic fungi. The strain W7 had inhibitory activity against 16 pathogenic fungi. It had strong inhibitory activity against plant pathogenic fungi ， ，（Edson） Fitzp， with strong antibacterial persistence and antibacterial stability. The strain also displayed weak antibacterial activity on plant pathogenic fungi ，. The fermentation extract showed good heat stability towards the mango pathogenic fungi Penz.， but the inhibition rate would decrease with the increase of water bath temperature. This is the first paper to investigate the termite-associated actinomycetes in Hainan. Bioactivity evaluation revealed termite-associated actinomycetes could be good resources for discovering biocontrol agent to control crop disease.

termite; symbiotic actinomycetes; plant pathogenic fungi; biocontrol agent

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.017

放线菌（Actinomycetes）是一种革兰氏阳性、高G+C含量的原核微生物，也是生物活性化合物的主要來源之一。最广为人知的便是抗生素，约有70%的天然抗生素来源于放线菌。这些次级代谢产物被应用在抗癌、免疫抑制剂、抗真菌等领域，其中对人类贡献最大的是制成抗菌剂。随着时间的推移，土壤来源的新放线菌及活性良好的天然产物发现概率逐渐下降，寻找新的放线菌来源成为目前的研究热点。昆虫是地球上最多样化的动物群体，几乎占据了每一个环境生态位。昆虫在长期进化的过程中，其体内的共生和/或致病微生物已经适应昆虫作为宿主。由于特殊的生活方式和取食行为，昆虫往往容易受到环境的威胁和病原体的侵扰，群居昆虫表现更为明显。昆虫可以通过体内共生菌群产生的天然产物作为防御手段抵抗这些威胁。白蚁（Isoptera）作为一种社会性昆虫，逐渐成为发现新的生物活性化合物的重要来源。

白蚁大量生活在热带和亚热带地区，温带地区也有发现。自然环境中，它们在复杂生物聚合物的转化中发挥作用，同时，还增加土壤通气性和排泄性。但是，白蚁的筑巢和觅食活动主要在土壤和腐烂的木材上进行，营养物质少且易受环境病原微生物入侵。因此，白蚁要依赖肠道密集多样的微生物菌群获取营养以及形成防御体系。放线菌则是其中一个重要的类群。研究人员在高等和低等白蚁的肠道内、巢穴及其周围土壤均发现大量共生放线菌。白蚁共附生放线菌是一个相对研究较少的特殊环境微生物，是新颖天然产物的来源之一，其研究尚处于起步阶段，目前只对少部分白蚁共附生放线菌产生的小部分天然产物进行了研究。例如，VISSER等发现白蚁共生放线菌产生的化合物能抑制假木霉（）对白蚁的入侵。胡松英等发现一株白蚁共生链霉菌属菌株BY02，其粗提物对苹果腐烂菌（）、杨树溃疡病菌（）和番茄早疫病菌（）具有抑制效果。共生菌是生防菌的主要来源，因此，对白蚁共生放线菌分离及其抗植物病原真菌的研究、开发显得十分重要，也对农业等社会生产领域具有重要的应用意义。

真菌感染位居植物病害起因的首位，能导致作物大量减产。农用抗菌剂、杀虫剂等化学品对作物生产具有显著效果，得以满足全球农业的需求。但是，广泛使用化学农药对生态环境伤害极大，也会增强作物抗药性，对人体健康也有影响。随着人们环保意识的不断加强，寻求环保、高效的防治方法成为世界各国的研发目标。其中，微生物农药具有对作物安全性高、对环境友好、不易产生抗药性等特点而受到广泛关注。我国学者也提出了多个研究方向，其中包括活体微生物农药和代谢产物农药。

本研究从海南白蚁中分离并筛选出具有生防效果的共附生放线菌，并对其进行生物学鉴定;同时研究其对农业病原菌的抗菌稳定性、持效性和抑菌谱，研究结果将为研发高效的生防菌剂提供资源。

  材料与方法

  材料

1.1.1  供试样品  供试白蚁采自位于海南省海口市龙华区学院路4号的中国热带农业科学院植物园区内，装入自封袋，带回实验室处理。

1.1.2  供试菌株  龙船花炭疽霉（）：菌株编号LCT;小叶龙船叶点霉（）：菌株编号XLY;小叶龙船拟盘多毛孢霉（）：菌株编号XLN;火龙果桃吉尔霉（）：菌株编号HLT;芦笋拟茎点霉（）：菌株编号LSN;豇豆棒孢霉（sp）：菌株编号JDB;木瓜二孢霉（）：菌株编号MGE;木瓜拟茎点霉（Fetrak & Cif.）：菌株编号MGN;芒果胶孢霉（Penz.）：菌株编号MGJ;木瓜炭疽霉（Penz.）：菌株编号MGT;椰子奇异串根霉（）：菌株编号YZQ;香蕉炭疽霉（）：菌株编号XJT;辣椒炭疽霉（sp）：菌株编号LJT;辣椒棒孢霉（）：菌株编号LJB;豇豆瓜果腐霉[（Edson） Fitzp]：菌株编号JDG;荔枝疫霉（）：菌株编号LZY。以上供试植物病原菌均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离保存。

 方法

1.2.1  共附生放线菌的分离与纯化  将采集的15只白蚁在无菌水中清洗3次，然后浸入75%酒精中表皮消毒30 s，最后用无菌水漂洗3次。虫体置于无菌研钵，加入少量无菌水研磨，用无菌水进行梯度稀释（稀释倍数为10、10、10、10），取各梯度稀釋液150 μL涂布于高氏一号培养基平板（含50 μg/mL重铬酸钾），28℃恒温培养。根据菌落形态和大小，挑取平板上菌落孢子或边缘菌体进行纯化培养、编号。纯化后分别于甘油管-20℃保存。

1.2.2  拮抗放线菌初筛、复筛  以香蕉炭疽霉XJT、芒果胶孢霉MGJ、龙船花炭疽霉LCT、辣椒棒孢霉LJB作为指示菌，采用平板对峙法进行初筛，观察有无抑菌带，筛选具有拮抗作用的共生放线菌。

对有良好拮抗活性的放线菌进行复筛，采用平板对峙法，以只接病原真菌块为对照组，直至对照组长满平板后进行观察。每个处理重复3次，十字交叉法测量菌落直径，求出菌株对各病原真菌的抑菌率。抑菌率=[（对照组病原菌生长直径-病原菌块直径）-（处理组病原菌生长直径-病原菌块直径）]/（对照组病原菌生长直径-病原菌块直径）×100%。

1.2.3  拮抗放线菌的抗菌持效性研究  以芒果胶孢霉MGJ为指示菌，采用平板对峙法，以只接种病原真菌为对照组，28℃恒温培养，每个处理重复3次。培养7、15、30、40 d后观察，计算各时期的抑菌率。

1.2.4  拮抗放线菌的抗菌稳定性研究  以芒果胶孢霉MGJ为指示菌，采用平板对峙法，平板培养基上连续转接5代拮抗放线菌，以此作为处理组，以只接种病原真菌为对照组，28℃恒温培养10 d，计算指示菌的抑菌率。

1.2.5  抑菌物质的热稳定性研究  利用链霉菌培养基2号（international streptomyces project medium No.2， ISP 2）固体平板对活性放线菌进行固体发酵。在长满放线菌的种子平板上倒入3 mL无菌水，用接种环刮落孢子制成菌液，然后吸取150 μL菌液涂布于新鲜的ISP 2平板上，共涂布100个直径9 cm的ISP 2平板，培养10 d后，将固体平板用甲醇浸提3次，用旋转蒸发仪减压浓缩后合并得到粗提物。

粗提物溶解为浓度1 mg/mL的溶液，均分为4份，分别置于40、50、60℃温度下水浴1 h。以芒果胶孢霉MGJ为指示菌，采用滤纸片平板对峙法，无菌水作阴性对照，对照组为不作处理的溶液，每张滤纸片加10 μL溶液，每个处理重复3次，28℃恒温培养5 d后，计算指示菌的抑菌率。

1.2.6  抗放线菌的抗菌谱研究  以菌株编号为HLT、XLY、XLN、LCT、LSN、LJT、JDB、MGE、YZQ、MGJ、MGN、MGT、XJT、LJB、JDG、LZY的16株病原真菌作为指示菌，采用平板对峙法，以只接种病原菌块为对照组，每个处理重复3次，计算各指示菌的抑菌率，评价拮抗共附生放线菌的抗菌广谱性。

1.2.7  拮抗放线菌16S rRNA基因序列分析  将菌株W7单菌落接种到ISP 2平板固体培养基中，28℃培养5 d，使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型）提取总DNA，PCR扩增选择通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR反应体系总体积50 μL。扩增条件为预变性98℃，2 min，变性98℃，10 s，退火56℃，10 s，延伸72℃，10 s，35个循环;终延伸72℃，5 min。0.8%琼脂糖凝胶用于检测PCR反应后获得的片段（电压300 V，时间12 min），使用凝胶成像仪观察电泳结果，阳性结果送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序。将获得的序列在NCBI网站进行BLAST相似性比对，选择相似度大于98%的菌株的16S rRNA基因序列作为参比对象，在MEGA-X软件中进行多序列比对，通过邻接法（neighbor-joining）进行聚类分析和构建系统发育树，根据Kimura two parameter模型评估系统进化矩阵，自展值（bootstrap value）1000次用于评估进化树拓扑结构的稳定性。

  数据处理

采用Excel 2019软件对数据进行处理，采用SPSS 19.0软件对实验数据进行处理并作统计分析，处理组间显著性差异用单因素方差分析和Turkey多重比较检验法。

结果与分析

  共附生放线菌的分离与纯化

从中国热带农业科学院海口院区采集的白蚁样品中分离得到4株放线菌，菌株编号为t55、t108、t198、W7。

 拮抗共生放线菌的初筛、复筛

4株共生放线菌通过平板对峙法进行抗菌活性初筛和复筛，筛选得到1株对供试病原菌有较好抑制作用的放线菌菌株W7（图1）。结果显示对4株供试真菌都具有抑制作用。对芒果胶孢霉（）抑菌率为72.73%，对龙船花炭疽霉（）抑菌率为60.87%，对辣椒棒孢霉（）抑菌率为59.15%，对香蕉炭疽霉（）抑菌率为57.14%。根据初筛和复筛试验，选取芒果胶孢霉作后续试验菌株。

  拮抗放线菌拮抗作用的持效性研究

通过测量不同时间病原菌菌落直径变化，结果表明，对照组病原菌落直径由57.21 mm增长至84.20 mm，接种拮抗放线菌W7的病原菌落直径由20.19 mm增长至36.09 mm。接种拮抗放线菌W7的处理组30 d内病原菌落生长速度明显慢于对照组，表明菌株W7能够较持久抑制病原菌的生长。

菌株W7不同世代的菌株对芒果胶孢霉MGJ均有抑制效果，且抑制效果较好。菌株W7从第1代至第5代的抑菌率在70.83%～73.18%之间波动。虽然抑菌率有所变化，但波动范围较小，说明菌株W7对芒果胶孢霉MGJ的抑制作用较稳定。

菌株W7不同培养时间下对芒果胶孢霉的抑菌效果如表1，抑菌率随培养时间的延长呈下降趋势，最后趋于稳定。接种15 d后的抑菌率与接种7 d后的抑菌率呈显著差异，15 d后抑菌率下降速度变慢，30 d后抑菌率趋于稳定，达67.53%。表明，菌株W7对病原菌抑制作用较持久。

 抑菌物质的热稳定性研究

菌株W7粗提物在不同温度下对芒果胶孢霉MGJ的抑菌率见表2，抑菌率随温度升高而降低，60℃高温下仍对病原菌有较好的抑制作用。因此，菌株W7的抑菌物质有较好的热稳定性。

 拮抗共附生放线菌抗菌谱研究

菌株W7对菌株编号为HLT、XLY、XLN、LCT、LSN、LJT、JDB、MGE、YZQ、MGJ、

MGN、MGT、XJT、LJB、JDG、LZY的16株病原真菌均有抑制效果，表明菌株W7的抗菌谱较广，并且该菌株对豇豆瓜果腐霉菌JDG、小叶龙船拟盘多毛孢霉菌XLN、木瓜拟茎点霉菌MGN均具有较强的抑制作用，对炭疽类病原菌MGJ、LCT、LJT和XJT普遍具有较好的抑制活性，但对芦笋拟茎点霉菌LSN、荔枝疫霉菌LZY抑制作用最弱（表3）。

  菌株分子鉴定

用16S rRNA基因通用引物对菌株W7进行序列扩增并测序，得到1365 bp左右的序列，经BLAST比对，选取相似性较高且有效发表的菌株进行16S rRNA基因序列的系统发育分析，结果表明，菌株W7与链霉菌属KC-106聚在同一分支上（图2）。比对结果显示菌株W7属于链霉菌（sp.）。

  讨论

本文首次对海南白蚁来源的放线菌进行了研究，抗农业病原菌活性筛选发现链霉菌菌株sp. W7对多种热带作物病原真菌具有不同程度的体外拮抗活性，表明其抗菌谱较广，此外它还具有一定程度的专一性，能较好抑制炭疽类病原真菌。进一步对其进行活性评价，发现该菌株对芒果胶孢霉MGJ的抑制作用随时间的延长逐渐降低，后趋于稳定趋势。接种7 d左右对照组菌落正常生长，处理组因拮抗放线菌的抑

制作用，指示菌生长速度较慢，抑菌率较高，7～ 15 d病原菌对拮抗菌产生一定抗性，因此抑菌率下降较快，15 d后可能由于培养皿直径大小、培养基营养不足等因素的限制，抑菌率下降趋势变缓，30 d后抑菌率无明显变化。上述结果表明菌株W7对芒果胶孢霉MGJ的抑菌持效性较好。进一步研究发现sp. W7不同世代的菌株对芒果胶孢霉MGJ均表现较好的抑制作用，抑制率较高，表明菌株W7的抗菌稳定性较好。

菌株W7的粗提物溶液在高温仍对芒果胶孢霉MGJ有较明显的抑制作用，表明该菌株产生的抑菌物质可能在自然条件下具有较好的热稳定性。今后将对该菌株产生的抑菌物质进行分离纯化，并鉴定其结构类型，为相关农用药物的研发提供先导物质。

如前言所述，当前关于白蚁共生菌群的天然产物及其生物活性研究较少。本研究分离得到的放线菌株W7与胡松英等从白蚁中分离的链霉菌BY02经BLAST比对，2株链霉菌同属不同种。但与SRIPREECHASAK等从土壤中分离得到的菌株 KC-106相似性高。关于海南省白蚁的研究主要集中于生物学特性研究，尚未见海南白蚁共附生放线菌的相关研究。因此，研究这类新型放线菌资源对海南特色生物资源的挖掘利用具有重要指导意义。目前，基于PacBio测序技术已对该菌株的全基因组进行了测序及拼接组装，获得了完整的基因组。进一步通过antiSMASH（https：//antism­ash. sec­ond­arymetabolites.org）在线分析其基因组中负责次级代谢产物合成的基因，预测出33个次级代谢产物生物合成基因簇（尚未发表）。后续研究工作将重点开展活性物质分离、鉴定、活性物质生物合成基因簇的挖掘和大田活性评价等方面，为热带作物病害的绿色防控提供基础资源。

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