油棕甾醇合成关键酶基因DWF5的克隆及表达分析

张为圣　刘智超　曹红星　颜彦　陈萍　李睿

摘  要：（）基因，编码7-脱氢胆固醇还原酶（7-dehydrocholesterol reductase），是甾醇合成的关键酶，通过调控甾醇的合成参与植物油体（oil bodies，OBS）的形成。为了探究基因对油棕果肉中油体发育的影响，以‘热油4号’为材料，提取油棕果肉的RNA，以反转录的cDNA为模板进行基因的全长克隆，获得2个基因并分别命名为和。運用生物信息学的方法对其理化性质、结构特点和亲缘关系等进行分析预测，利用实时荧光定量PCR对其在油棕的根、茎、叶、花及花后不同时期的果实进行表达水平分析。结果表明：和基因编码的氨基酸数量分别为434个和374个，相对分子质量为49.71 kDa和42.68 kDa，等电点为8.61和8.69，其蛋白不稳定指数为38.60和38.13，脂肪族指数为98.80和96.68，总平均亲水性为0.347和0.313，均具有疏水性。与水稻和玉米亲缘关系最近，与其他物种关系较远。qRT-PCR分析表明，基因在油棕的各个器官均有表达，其中基因在果肉中高表达，显著高于根、叶、花等部位，其表达趋势为花后12～18周升高，至20周时达到最高后表达量逐渐降低，这与油棕果肉中油体的发育趋势基本一致。基因在根和茎中高表达而在果肉中表达量低，其果肉中表达趋势为花后12～18周逐渐降低。因此，推测参与调控油棕的油体发育，未参与该调控而可能在油棕的生长发育中发挥功能。本研究为进一步探索基因调控油棕中油体的形成机制奠定基础。

关键词：油体;;生物信息学;基因表达中图分类号：S565.9      文献标识码：A

Cloning and Expression Analysis of Genes Involved in the Sterol Synthesis in Oil Palm

ZHANG Weisheng LIU Zhichao CAO Hongxing YAN Yan CHEN Ping LI Rui

1. College of Horticulture， Hainan University / Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Crops of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339， China; 3. Sanya Nanfan Research Institute， Hainan University， Sanya， Hainan 572025， China; 4. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

（） encodes 7-dehydrocholesterol reductase， which is a key enzyme in the synthesis of sterols and participates in the formation of plant oil bodies （OBS） by regulating the synthesis pathway of sterols. The cultivar， ‘Reyou No. 4’， was taken as the experimental material to explore the effects of gene on the development of OBS in the mesocarp of oil palm. After extracting RNA from mesocarp， the reverse transcription cDNA was used as a template to conduct full-length cloning of genes. Two genes obtained were named and . The bioinformatics method was applied to analyze and predict physicochemical properties， structural characteristics， and genetic relationship， etc.. The expression levels of the genes in roots， stems， leaves， flowers， and fruits at different stages after flowering were analyzed by quantitative real-time PCR. The results showed that the number of amino acids encoded by the gene was 434 and 374， respectively， the relative molecular masse was 49.71 kDa and 42.68 kDa， the isoelectric points was 8.61 and 8.69， the protein instability indexes was 38.60 and 38.13， and the aliphatic index was 98.80 and 96.68. The gravy was 0.347 and 0.313. Both proteins were hydrophobic. has the most closed genetic relationship with rice and maize， but less related to other species. The qRT-PCR analysis showed that the two genes were expressed in all organs of oil palm， among which was highly expressed in mesocarp， which was significantly higher than that in roots， leaves， flowers and other parts. The expression trend of gene increased from 12 to 18 weeks after flowering and reached the peak at 20 weeks after flowering， and then gradually decreased， which was consistent with the synthesis trend of the OBS in the oil palm mesocarp. gene was highly expressed in roots and stems， but the expression level of it was low in mesocarp， and its expression trend in mesocarp gradually decreased from 12 to 18 weeks after flowering. Therefore， it is speculated that is involved in the regulation of development of OBS in oil palm， while is not involved in this regulation and may play a role in the growth and development of oil palm. This study would lay a foundation for further exploring the mechanism of regulating OBS formation in oil palm.

oil bodies; ; bioinformatics; gene expression

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.001

油体（oil bodies，OBS），又称为脂肪体（lipid bodies），或者脂肪滴（lipid droplets，LDS），是植物体内主要进行能量储存和脂质代谢的细胞器，由三酰甘油（TGs）和甾醇酯等组成，为多数真核植物所有。除甾醇和三酰甘油之外，油体中还含有多种生物活性成分，如异黄酮、生育酚和各类小蛋白，这些成分同样参与油体的形成，维持和稳定油体的大小和数量。油体被认为是由内质网（ER）磷脂双分子层中间的中性脂质积累而成。内质网的中性脂质与其膜结合后进入细胞质，最终由内质网中的单磷脂分子层环绕而成为油体。其中甾醇通过调节膜的流动性和渗透性，以及在转录水平和信号转导途径中参与油体的形成。

油体中的甾醇是在内质网中由异戊二烯通过甲戊酸途径合成，该过程涉及到的酶促反应包括甲基化、去甲基化、还原、异构化等。有12种酶参与代谢途径，包括甾醇C24甲基转移酶1、甾醇甲基氧化酶2、7-脱氢胆固醇还原酶和甾醇C22去饱和酶等。DWF基因家族的许多成员均参与了甾醇的合成，如和参与谷甾醇和芸苔甾醇的合成，、和参与油菜素内酯的合成，参与油菜烷醇的合成调控。其中基因调控的7-脱氢胆固醇还原酶能将5-脱氢胆固醇催化为亚甲基胆固醇，也能将5-脱氢燕麦甾醇催化为异岩藻甾醇，二者均是甾醇合成中的关键限速步骤。常见的油料作物如花生和油菜中含有2个基因，芝麻和大豆中含有1个基因，而其他作物如拟南芥、烟草、葡萄、番茄等中均发现基因。最近的研究表明，基因通过调控甾醇的合成能够参与植物中油体的发育。拟南芥突变体与野生型相比，组织中磷脂和总游离甾醇含量的减少使叶片中油体含量严重下降。烟草LAB1-4突变体与野生型相比，愈伤组织中甾醇含量的升高使组织中油体含量增多。油菜中植物的含油量与总甾醇呈显著正相关。这些结果表明了甾醇的含量对植物中油体的积累有着重要的作用。

油棕（Jacq）是世界上产油率最高的油料作物，其棕榈油被广泛应用于食品、化妆品、工业等领域，现已成为世界上生产量和贸易量最大的植物油。油棕的果肉中含有丰富的棕榈油，果肉细胞中发达的油体与甾醇的积累密切相关，但对其调控油棕油体发育的相关基因鲜见报道。本研究从油棕中克隆了2个的同源基因和，对其理化性质、序列特征和进化关系进行分析，同时采用荧光定量PCR对其在油棕果实发育中的表达特征进行分析，为后续研究的生物学功能和利用该基因对油棕开展遗传改良工作奠定基础。

  材料与方法

 材料

试验材料来源于中国热带农业科学院椰子研究所（海南省文昌市）基地（19°33′N，110°47′E），采集8年生的‘热油4号’油棕新品种的根、茎尖、叶、花，并取开花后生长12、14、16、18、20、22周果实。其中根和茎等材料收集后立即置于液氮中速冻，果实在收集时将果肉和果仁分开后速冻，于–80℃冰箱中储存备用。

 方法

1.2.1  基因的挖掘和生物信息学分析  从拟南芥基因数据库（https：//www.arabidopsis.org/）中查找拟南芥AtDWF5（AT1G50430）的氨基酸序列。油棕基因组数据库中采用BLASTP进行比对分析获得与高度同源的候选基因，利用Batch Web CD-search Tool进行该基因的保守结构域分析。引物设计采用NCBI官网上的Primer-Blast在线工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/）进行分析。以油棕的果肉cDNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增，获得目的基因后纯化并连接至PMD18-T载体中，通过热激法转化至DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆并送至公司测序。油棕DWF5的蛋白质分子量和等电点等理化性质均采用在线工具ExPASy（http：// www.expasy.org）进行分析。采用ClustalX对油棕、拟南芥、烟草和番茄的DWF5蛋白质序列进行多重比对，系统进化树采用MEGA 6.0的Neighbor-joining法进行构建，bootstrap的校验值设置为1000。

1.2.2  RNA的提取和基因表達分析  使用北京天根公司生产的RNA提取试剂盒提取油棕的根、茎、叶、花和果肉等器官的RNA，通过北京全式金生产的反转录试剂盒获取cDNA。实时荧光定量PCR采用SYBR Select Master Mix进行分析，作为内参基因，反应体系及操作步骤参照该试剂盒操作说明书进行，引物见表1，基因相对表达量采用2法进行计算。

 数据处理

利用Excel软件进行原始数据的计算和处理，利用SPSS 25.0软件作为统计分析工具，利用GraphPad Prism 8.0软件制图。采用Duncan’s检验法进行油棕基因表达的差异显著性分析。

结果与分析

2.1  的克隆及基本信息分析

以油棕果肉cDNA为模板，进行油棕基因全长克隆，获得2条单一条带，长度在1600 bp

左右，将其分别命名为、（图1）。测序结果显示，条带长度为1621 bp，编码的氨基酸为434个，条带长度为1577 bp，编码氨基酸374个;其相对分子质量分别为49.71 kDa和42.68 kDa;等电点分别为8.61和8.69;的蛋白不稳定指数为38.60，的蛋白不稳定指数是38.13，二者均为不稳定蛋白;脂肪族系数分别为98.80和96.68;总平均亲水性为0.347和0.313，均为正值，呈疏水性;定位在Chr8上，定位在Chr7上（表2）。EgDWF5-1中的氨基酸含量最多的是Leu（L）和Val（V），占比分别为10.8%和7.8%。EgDWF5-2中的氨基酸含量最多的是Leu（L）和Val（V），占比分别为10.4%和8.6%。

2.2  的序列比對及进化分析

将油棕、拟南芥、烟草和番茄的DWF5氨基酸序列进行多重比对分析。结果表明，4个物种中氨基酸序列有很高的同一性（图2）。采用MEGA 6.0的Neighbor-joining法将EgDWF5的氨基酸序列与烟草、拟南芥、番茄、葡萄、水稻、玉米的DWF5序列进行进化分析，结果发现，2个EgDWF5聚类在一个分支上，并与水稻和玉米的DWF5聚类到一个大分支上，说明油棕的DWF5与水稻和玉米亲缘关系较近，与其他物种关系较远（图3）。

2.3  的表达特征分析

采用实时荧光定量PCR对2个基因在油棕的根、茎、叶、花和花后各个时期生长的果仁和果肉进行基因表达特征分析。结果表明，在油棕果肉中基因表达量显著高于根、叶、花部位。基因的表达量在油棕的果实发育过程中表现出先升高后降低的趋势，其中，在果仁中，随着生长逐渐升高，并在18周达到最大值，随后缓慢下降;在果肉中，随着果肉生长至20周时达到最大值，随后降低。在果实中，基因在果肉的表达量显著高于果仁。在油棕果肉中低表达，其表达量显著低于根、茎和花，其表达趋势在12～18周逐渐降低。该基因在根中表达量显著高于叶、花等部位（图4）。

植物和藻类等生物中含有对食品和能源工业非常重要的油脂，油脂的主要积累部位是油体。油体的发育起源于内质网，主要由三酰甘油和甾醇酯组成。其中甾醇的合成是环丙烯醇经过多种酶代谢的结果。有许多DWF家族成员参与甾醇的合成途径，油棕中发现的DWF同源基因有1个、1个、2个、1个和1个等。其中基因控制的7-脱氢胆固醇还原酶是甾醇合成途径中的关键酶，主要调控甾醇的后期合成。

本研究从油棕中克隆了2个的基因，分别命名为和，分别编码的氨基酸为424个和374个;定位在Chr8上，定位在Chr7上。2个基因的蛋白不稳定指数为38.60和38.13，均为不稳定蛋白;总平均亲水性为0.347和0.313，均为正值，呈疏水性;EgDWF5-1含量较多的氨基酸是Leu（L）和Val（V），占比分别为10.8%和7.8%。EgDWF5-2含量较多的氨基酸是Leu（L）和Val（V），占比分别为10.4%和8.6%。多序列对比结果显示，EgDWF5与烟草、拟南芥和番茄的DWF5氨基酸序列具有很高的同一性。进化关系分析发现，与水稻和玉米的亲缘关系相近，与其他物种关系较远。对油棕不同部位的基因表达分析结果发现，2个基因在根、茎、叶及花和果实中均有表达。果实是油棕唯一的产油器官，其含油量随果实的发育而升高，在花后5个月达到最高，果肉中含油率在成熟期可高达50%。本研究中在果实中的表达量显著高于根、叶和花等部位，在根和茎中的表达量显著高于其他部位。的基因表达量随果肉的生长逐渐升高，在花后20周达到最高随后下降，其表达趋势与果肉中的含油量基本一致，这可能是在油棕果实成熟过程中基因表达量上调，提高了7-脱氢胆固醇还原酶的活性，使组织中获得了更多的游离甾醇，这些甾醇提高了膜的流动性和渗透性，使内质网可合成更多的油体并储存在细胞质中。因此基因在细胞中的高表达可能是油棕果实高含油量的原因。在油棕的果实中表达量低，并在果实的成熟过程中远低于根、茎、花等部位，而该基因在根和茎的表达量比其他部位的表达量高，这与番茄中的研究结果一致，其原因可能是因为油棕的基因功能产生了分化，其中参与了油棕果实中油体的发育，未参与果实中油体的发育，而参与了植株的生长发育，在拟南芥和黄瓜的研究中发现基因缺失导致了植株的矮化，因此推测可能参与了植株的生长发育。

综上所述，本研究从油棕中克隆得到2个基因，对其蛋白质理化性质和进化关系进行分析，并对2个基因在油棕的不同器官和组织进行基因表达特征分析。结果表明，在果肉中高表达，推测其对油棕果实中油体的发育起着重要的调控作用。在果肉中表达水平低而在根和茎中表达水平高，推测未能参与油棕果肉的油体发育，而是在植株的生长发育中参与调控。本研究结果为探究油棕果实中油体发育的相关基因提供了一定的参考，关于其在油棕的油体发育中具体功能还有待进一步的研究。

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