欧洲鳗肌肉蛋白营养评价及体外模拟消化特性

孙梦莹，石林凡，2，3，任中阳，2，3，陈 俊，2，3，郝更新，2，3，翁武银，2，3*

（1 集美大学食品与生物工程学院 福建厦门 361021 2 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心 福建厦门 361021 3 厦门市海洋功能食品重点实验室 福建厦门 361021）

鳗鲡（Anguilla）是一种江河性洄游鱼类，在全世界有19 种，其中日本鳗、欧洲鳗和美洲鳗属于重要的养殖品种[1]。我国是鳗鲡养殖、生产和出口大国，2019年福建和广东两省的鳗鲡年产量高达20 万t[2]。

高蛋白和高脂肪是鳗鲡肌肉的主要特征[3]，对鳗鲡加工产品的品质有重要影响。通常，富含油脂的鳗鲡主要被加工成烤鳗产品[4]。烤鳗加工中鳗鲡肌肉蛋白和脂质不仅会发生分解和氧化反应，而且彼此间会发生相互作用，影响鳗鲡加工产品的营养品质。有研究报道，脂质在热加工中容易发生氧化，在脂质次生氧化物的间接作用下蛋白质的结构和功能性质容易发生变化[5]。然而，关于加热对鳗鲡肌肉蛋白消化特性的影响研究尚未见报道。

蛋白质的营养价值主要取决于必需氨基酸的种类、含量和组成，以及蛋白质消化和代谢的量，而吸收的氨基酸可以调节机体的新陈代谢[6-7]。Zhou 等[8]研究加热处理对金华火腿肌原纤维蛋白体外模拟消化的影响时，发现100 ℃加热的火腿中肌原纤维蛋白消化率高于70 ℃处理的火腿，而低于120 ℃处理的火腿。适度加热促进蛋白多肽链的展开，而过度加热导致蛋白质发生交联和聚集，对蛋白质的消化率和生物活性产生影响[9]。还有研究表明，过度加热导致食源性碳量子点的形成，抑制胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性，进而影响蛋白质的消化[10]。

目前鳗鲡加工产品主要是烤鳗，产品单一且以出口为主。鳗鲡产业抵御市场的风险能力非常薄弱。有关鳗鲡加工的研究主要集中在鳗鲡产品的质量安全和监控等方面。鳗鲡肌肉蛋白的营养评价鲜有报道。本研究以欧洲鳗为原料，评价鳗鲡肌肉蛋白的营养品质，以及加热对鳗鲡蛋白消化特性的影响，旨在为研发高品质的鳗鲡热加工产品提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

欧洲鳗购于当地水产品批发市场。乙腈及甲醇，美国INC 公司；邻苯二甲醛、氯甲酸-9-芴甲基酯，美国Agilent 公司；盐酸、胰酶、胃蛋白酶，中国上海国药集团化学试剂有限公司；十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulphate，SDS）、丙烯酰胺，美国Bio-Rad 公司。

1.2 仪器与设备

1200 高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；AI600 多色荧光凝胶成像仪，美国GE Healthcare公司；Avanti J-25 高速冷冻离心机，美国Beckman公司；SK-SO35 多功能蒸汽焗炉，日本山崎（国际）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鳗鲡肌肉蛋白的提取 鳗鲡水溶性蛋白（water-soluble protein，WP）的提取参考Zheng 等[11]的方法。取鳗鲡白肉切成小块，按质量体积比为1 ∶15 加入蒸馏水后进行匀浆，利用高速冷冻离心机离心，获得的上清液在碎冰上静置并去除冻结的油脂，经冷冻干燥后制备成WP。鳗鲡盐溶性蛋白（salt-soluble protein，SP）的提取参考了Bertram等[12]的方法。将上述离心后的沉淀加入与20 mmol/L PBS（pH 7.0）混合配制为50 g/L 的溶液并进行匀浆，再次离心，获得的沉淀和0.6 mol/L KCl溶液混合配制为100 g/L 的溶液并匀浆，离心后收集上清液，用蒸馏水透析除盐，冷冻干燥后制备成SP。

1.3.2 鳗鲡油脂的提取 鳗鲡油脂的提取参考Lin 等[13]的方法并稍作修改。取鳗鲡白肉切成小块，按质量体积比为1 ∶10 加入蒸馏水并进行匀浆，沸水浴15 min 后进行离心，在上清液中加入质量浓度为20 g/L 的白色硅藻土，4 ℃保存120 min 后，再次离心，获得的上清液冷冻干燥后作为本研究的鳗鲡油脂使用。

1.3.3 基本成分测定 水分测定参照GB 5009.3-2016 直接干燥法；粗蛋白质测定参照GB 5009.5-2016 凯氏定氮法；粗脂肪测定参照GB 5009.6-2016 索氏抽提法；灰分测定参照GB 5009.4-2016马福炉灼烧法。

1.3.4 氨基酸组成分析及其营养评价

1.3.4.1 氨基酸组成的测定 参照Shi 等[14]报道

的氨基酸测定方法。样品用6 mol/L HCl 溶解，在充满氮气的消化管中于110 ℃消化22 h，通过旋转蒸发去酸后再用0.02 mol/L HCl 溶解，经0.22 μm 水系膜过滤后，利用高效液相色谱仪测定样品的氨基酸组成。色谱柱为Agilent Zorbox Eclipse AAA 柱（4.6 mm×150 mm）；流动相A 为40 mmol/L的磷酸二氢钠（pH 7.8），流动相B 为有机相（乙腈∶甲醇∶超纯水=45∶55∶10，V/V）；流速为2 mL/min，梯度洗脱；紫外检测波长为338.10 nm 和262.16 nm。其中，色氨酸采用碱水解后再利用高效液相色谱仪测定。

1.3.4.2 氨基酸营养价值评价 根据联合国粮农组织/世界卫生组织（food and agriculture organization of the united nations/world health organization，FAO/WHO） 推荐的氨基酸评分标准模式和鸡蛋蛋白质的氨基酸模式，分别按以下公式计算氨基酸评分（essential amino acid scores，EAAS）、必需氨基酸指数（essential amino acid index，EAAI）、生物价（biological value，BV）和蛋白质效率比（protein efficiency ratio，PER）[15]。

式中：n——比较的EAA 个数；a，b，c，...，h——待评蛋白质的EAA 含量（g/100g）；ae，be，ce，...，he——鸡蛋蛋白质相应的EAA 含量（g/100g）。

1.3.5 模拟烤鳗加热处理 将WP 和SP 分别与油脂按照鳗鲡肌肉基本成分组成的比例（脂肪20%、蛋白15%和水分65%）混合后，模拟烤鳗的加热条件（80 ℃烘烤10 min，然后95 ℃蒸煮5 min，最后90 ℃烘烤3 min），对鳗鲡肌肉、WP 和SP 进行加热，制备的样品冷却至室温后供以下试验使用。

1.3.6 体外模拟消化 参照Cinq-Mars 等[16]的方法进行体外模拟胃肠液消化试验。将样品分散于pH 1.5 的盐酸水溶液中，配制的样品溶液按质量比3∶100（酶/蛋白）加入胃蛋白酶，混匀后在37 ℃恒温振荡水槽中酶解60 min。获得的模拟胃消化液利用1 mol/L NaOH 将消化液的pH 值调至7.5，按质量比4 ∶100（酶/蛋白）加入胰酶，混匀后在37 ℃恒温振荡水槽中酶解60 min。在消化过程中对消化液进行电泳分析，并对消化产物的游离氨基酸进行分析。

1.3.6.1 Tricine-SDS-PAGE 利用含有2% SDS、8 mol/L 尿素和20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）的蛋白变性剂溶解消化产物，根据Schägger[17]报道的方法进行Tricine-SDS-PAGE 分析。

1.3.6.2 游离氨基酸的测定 游离氨基酸的测定参照Liu 等[18]报道的方法并稍作修改。样品溶液加入相同体积100 g/L 磺基水杨酸，混匀后室温静置120 min，离心后获得的上清液于55 ℃下浓缩蒸干，再用0.02 mol/L HCl 溶解，按照1.3.4.1 节的方法对氨基酸组成进行测定。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 17.0 软件对所得数据进行ANOVA 方差分析，显著性检验方法为Duncan 多重检验，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 鳗鲡肌肉组分分析

表1显示了鳗鲡肌肉的基本成分。除了水分以外，鳗鲡肌肉中脂肪含量最高，表明鳗鲡属于多脂鱼类，这与罗鸣钟等[3]的研究结果类似。通常鱼类肌肉的水分含量为73%～82%[19]。然而，在鳗鲡肌肉中水分含量却只有67.06%，这可能是鳗鲡肌肉脂肪含量高达19.72%的缘故。也有研究表明，大西洋鲑鱼肌肉脂肪含量越高的部位水分含量越低[20]。

表1 鳗鲡肌肉基本成分（%，湿重；n=3）Table 1 Compositions of eel muscle（%，wet weight；n=3）

2.2 氨基酸组成分析

蛋白质的氨基酸组成是决定蛋白质营养价值的重要依据，因此对鳗鲡肌肉及其WP 和SP 的氨基酸进行测定，结果如表2所示。在鳗鲡肌肉WP的EAA 中，赖氨酸占比最高，其次是亮氨酸。类似的趋势也在鳗鲡SP 的EAA 中观察到。除了缬氨酸和苯丙氨酸，SP 中的其它6 种EAA 占比都高于WP。有研究报道，赖氨酸可以促进机体生长发育和矿物质的吸收，进而增强免疫力[21]，亮氨酸可以调节肌肉中蛋白质的合成[22]。Mohanty 等[23]对27种食用鱼类肌肉氨基酸进行分析，结果发现冷水鱼鱼肉的赖氨酸高达16.1%，海水鱼鱼肉的亮氨酸高达10.4%，而黄鳍结鱼的赖氨酸和亮氨酸分别为7.6%和9.4%，与鳗鲡肌肉最接近，这可能是黄鳍结鱼和鳗鲡都属于淡水鱼的缘故。鳗鲡肌肉EAA 介于WP 和SP 之间。鳗鲡肌肉中EAA 占总氨基酸比例达到37.81%，高于FAO/WHO（2013）的成人氨基酸标准模式（27.60%），说明鳗鲡肌肉是满足成人食用的优质蛋白。鳗鲡肌肉的必需氨基酸指数（EAAI）为84.27，高于其它鱼类如草鱼（72.43）[24]，表明鳗鲡肌肉的必需氨基酸组成较为合理，营养价值较高。根据EAAI 值的结果，还可以发现鳗鲡SP 的营养价值高于WP。蛋白质对人体的BV 与EAA 的含量密切相关，因此p-BV 值大小趋势与EAAI 相同。通常，PER 大于2.0 被认为是高质量的蛋白质，1.5～2.0 为中等质量的蛋白质，而小于1.5 则认为低质量的蛋白质[25]。鳗鲡肌肉的p-PER 为1.93，与罗非鱼（1.93）相近[26]，低于鲭鱼与鲱鱼[27]。这是由于欧洲鳗养殖在淡水中，因此其肌肉营养价值与淡水鱼相近，但是，SP 的p-PER 高达3.90，可以与海水鱼类蛋白相媲美。

表2 鳗鲡肌肉及其分离蛋白的氨基酸组成、必需氨基酸指数（EAAI）、蛋白质效率比（p-PER）和生物价（p-BV）（g/100 g，蛋白干重；n=3）Table 2 Amino acid profiles，essential amino acid index（EAAI），predicted protein efficiency ratio（p-PER），and predicted biological value（p-BV） of eel muscle and its isolated protein（g/100 g，dry weight basis；n=3）

参考FAO/WHO（2013）的标准氨基酸模型，对鳗鲡肌肉及其提取蛋白质的营养价值进行评价，结果如表3所示。WP 的第一限制氨基酸为甲硫氨酸+半胱氨酸，鳗鲡肌肉和SP 中的第一限制氨基酸为缬氨酸。除苯丙氨酸+酪氨酸外，SP 中必需氨基酸评分（EAAS）均高于WP，鳗鲡肌肉EAAS 介于WP 和SP 之间。鳗鲡肌肉的EAAS 评分最高的为色氨酸，据报道，色氨酸可以增强人体的免疫能力，其代谢产物褪黑素更是具有抗氧化和抗衰老等多种生理功能[28]。值得注意的是，除色氨酸外，苯丙氨酸+酪氨酸的评分也很高，结果表明鳗鲡肌肉必需氨基酸均衡性好。

表3 鳗鲡肌肉及其分离蛋白的必需氨基酸评分（EAAS，%）Table 3 Essential amino acid scores（EAAS，%）of eel muscle and its isolated protein

2.3 体外模拟消化

2.3.1 Tricine-SDS-PAGE 利用Tricine-SDSPAGE 对鳗鲡蛋白的体外模拟消化过程进行评价（图1）。鳗鲡WP 分子质量为12～97 ku 范围内可观察到多条清晰的蛋白条带。当WP 经胃蛋白酶消化15 min 后，只有97，55，45 和12 ku 及以下出现较淡的蛋白条带。伴随消化时间的延长，SDS-PAGE 中的蛋白条带数量逐渐减少（图1a）。当模拟胃消化产物经胰酶消化15 min 后，仅在55 ku 处出现较淡的蛋白条带。当鳗鲡SP 经胃蛋白酶消化15 min 后，大于100 ku 的蛋白条带立即消失（图1b）。随着胃蛋白酶消化时间的延长，除了80 ku 附近的蛋白条带以外其它蛋白条带逐渐变淡。当模拟胃消化产物经胰酶消化后，30 ku 以上的蛋白条带迅速消失，30 ku 以下的涂布状条带随着消化时间的延长逐渐变淡。这些结果表明，WP比SP 更容易被胃蛋白酶消化降解。Minkiewicz 等[29]在比较鲤鱼肌肉的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的体外模拟消化时，也发现肌浆蛋白比肌原纤维蛋白容易消化。鳗鲡肌肉除了WP 和SP 以外，还富含胶原蛋白，因此伴随胃蛋白酶的消化，胶原蛋白逐渐明胶化并溶解出来，在SDS-PAGE 中会呈现出一些与WP 和SP 消化不一样的蛋白条带（图1c）。然而，这些蛋白条带在胰酶消化中也都逐渐消失。

鳗鲡WP 和SP 与油脂混合后经过加热后，体外模拟消化的结果如图1c，1d，1f 所示。加热后的WP 在SDS-PGAE 中只出现小于10 ku 的蛋白条带，但随胃蛋白酶的消化蛋白条带数量先增加后减少（图1d）。这可能是在与油脂加热过程中WP出现聚集和交联，但在胃蛋白酶消化中逐渐溶解出来。然而，与油脂共同加热的WP 明显比未加热的WP 不易被胃蛋白酶消化（图1a 和1d）。虽然SP 与油脂加热后没有出现WP 那样产生大分子，但是与油脂共同加热的SP 在胃蛋白酶消化中比未加热的SP 多了一些蛋白条带（图1e）。模拟胃消化产物经胰酶消化后，WP 只有在55 ku 附近存在一些蛋白条带，而SP 却出现更多的蛋白条带。这些结果表明了与油脂共同加热后，SP 还是比WP 不容易消化。相对于未加热的鳗鲡肌肉，经过加热的鳗鲡肌肉也出现了WP、SP 与油脂共加热类似的现象（图1f）。

图1 鳗鲡肌肉及其蛋白体外模拟消化产物的Tricine-SDS-PAGE 图谱Fig.1 Tricine-SDS-PAGE patterns of in vitro digested products of eel muscle and its isolated protein

2.3.2 游离氨基酸 对鳗鲡肌肉及其蛋白体外模拟消化产物中的游离氨基酸组成进行分析，结果如表4所示。未加热的WP 和SP 经体外模拟消化后，其消化产物中都有高含量的亮氨酸和苯丙氨酸等游离氨基酸。WP 消化产物中还富含精氨酸和赖氨酸，而SP 消化产物中富含丙氨酸和酪氨酸。亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸为必需氨基酸，精氨酸和酪氨酸则属于半必需氨基酸，而且丙氨酸常用作营养补充剂，它们在机体免疫能力的增强、肌肉蛋白的合成与分解中起到重要的作用[22，30-32]。同样，在鳗鲡肌肉模拟消化产物中主要游离氨基酸也是精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和赖氨酸，占游离氨基酸总量的66.60%，表明这些游离氨基酸可能可以作为评价鳗鲡肌肉消化产物的营养指标。

不管鳗鲡肌肉WP，还是鳗鲡肌肉SP，它们与油脂共同加热再经过体外模拟消化后，模拟消化产物中的游离氨基酸总量均出现一定程度的增加，表明加热后可以促进蛋白消化。Semedo 等[33]研究蒸煮、烘烤和油炸对鱼肉体外模拟消化影响时，也发现不管采用哪种加热方式加热后的鱼肉都更容易被消化。而且，加热会使鳗鲡肌肉蛋白消化产物中的酪氨酸含量出现一定程度的下降（表4），这可能是鱼肉在热加工中形成的食源性碳量子点抑制了酪蛋白的消化[10]。值得注意的是，经过加热后模拟消化产物中的主要游离氨基酸的比例都出现了下降的趋势，也表明鳗鲡肌肉蛋白与油脂共同加热后会导致营养价值出现一定程度的下降。

表4 鳗鲡肌肉及其蛋白体外模拟消化产物的游离氨基酸组成（g/100 g，干重；n=3）Table 4 Free amino acid in vitro digested products of eel muscle and its isolated protein（g/100 g dry weight；n=3）

3 结论

通过对鳗鲡肌肉WP 和SP 的氨基酸组成分析，利用体外模拟消化分析蛋白与油脂加热前后的消化特征。结果表明，鳗鲡WP 中精氨酸含量明显高于SP，而SP 中必需氨基酸和呈味氨基酸高于WP，且SP 的氨基酸营养价值高于WP。不管是加热还是未加热，鳗鲡肌肉WP 均比SP 容易被消化。经过加热后，蛋白模拟消化产物中游离氨基酸占比明显增加，表明加热可以促进鳗鲡肌肉蛋白质的消化降解。然而，根据模拟消化产物的游离氨基酸的分析结果，表明加热会导致鳗鲡肌肉蛋白质的营养价值下降。