局部晚期宫颈癌组织Notch通路蛋白表达与以顺铂为基础的子宫动脉介入栓塞有效性的关系

皇甫政彤

局部晚期宫颈癌(LACC)是一种发病率仅次于乳腺癌的宫颈癌，在妇科恶性肿瘤中较为常见，我国也是宫颈癌高发的国家，每年新发病的患者约10万，死亡率在60%，并且发病率呈逐年上升的趋势，Ⅱb～Ⅳa期宫颈癌统称为局部晚期宫颈癌[1]。Notch信号通路是一种参与机体及组织分裂更新活动的重要手段，Notch信号通路主要是参与机体以及组织分裂的活动，结构具有保守性，在细胞的增生分裂过程中，发挥重要的作用，并且促进上皮组织物质交换速度。临床研究表明子宫动脉介入栓塞是Ⅱb期以上中晚期宫颈癌首选的治疗方法，但随着该方法的广泛应用，栓塞药物耐药性的问题也日益突出[2]。有研究指出[3]，人体大多数恶性肿瘤的发展与自身Notch信号通路存在密切联系。为了进一步探讨、验证LACC组织Notch通路蛋白表达与以顺铂为基础的子宫动脉介入栓塞有效性的关系，本研究选取98例LACC患者和95例宫颈良性肿瘤患者开展对照研究，详情如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

经过医院伦理委员会批准，选取本单位2019年4月至2020年7月收治的98例LACC患者和95例宫颈良性肿瘤患者，分别记为恶性组和良性组。恶性组年龄30～69岁，平均(52.95±4.55)岁，其中62例年龄≥50岁，36例<50岁；临床分期Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa期分别为35、15、29、19例；最大肿瘤直径4～10 cm，平均(5.45±0.95)cm，其中最大肿瘤直径≥6 cm 56例；未分化16例、低分化31例、中分化33例、高分化18例；有淋巴结转移36例；治疗情况：全身化疗53例，放射治疗45例。良性组年龄42～78岁，平均(53.11±4.65)岁，其中年龄≥50岁者60例，<50岁者35例；子宫肌瘤43例、卵巢囊肿30例、卵巢囊腺瘤22例。通过对比2组间数据，差异无统计学意义(P>0.05)。

纳入标准：①恶性组符合局部晚期宫颈癌诊断标准[4]，良性组均为宫颈良性肿瘤患者；②患者的肌瘤的血供为:极富血流型、富血流型、一般血流型；③均签署本研究知情同意书。

排除标准：①有严重的精神疾病、认知障碍等；②合并有心、肺、肝、肾等疾病；③患有感染性疾病，如肺炎、肝炎、流感等；④合并慢性病，如慢性呼吸系统疾病、糖尿病等；⑤合并乳腺癌、胃癌、肺癌等其他恶性肿瘤；⑥非富血流型肌瘤，肌瘤有较大间变、钙化、坏死等，带蒂的浆膜下肌瘤、阔韧带肌瘤。

1.2 方法

蛋白表达检测方法：主要试剂鼠抗人Notch1、Hes-1、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)单克隆抗体、酶标记的兔抗鼠Notch1、Hes-1、CyclinD1多克隆抗体，MaxVisionTM试剂盒二步法免疫组化、二氨基联苯胺法(DAB)显色试剂盒购自爱必信上海生物科技有限公司，0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=7.5)、国产分析纯试剂0.02 moL/L的枸椽酸盐抗原修复液(pH=6.0)，采用双蒸水配置。95例宫颈良性肿瘤组织在术中切取，98例LACC组织在治疗前活检获取。所有组织样板石蜡包埋，制片；采用二步法进行染色，按试剂盒说明书操作步骤进行。以已知标准片作为阳性对照，用磷酸缓冲液作阴性对照。判断结果:采用双盲法对光学显微镜下Notch1、Hes-1、CyclinD1染色的组织标本进行评估，当出现黄色颗粒为阳性细胞；并观察阳性细胞色度，根据百分比得分，阳性细胞数<5%为0；阳性细胞数当≥5%且<25%为1；当阳性细胞数≥25%且<50%为2；当阳性细胞数≥50%且<75%为3；染色强度的评分标准：不着色记为0分，蓝色或黄色记为1分，紫蓝色或棕黄色记为2分，蓝黑色或黄褐色记为3分；根据两者总分0～1为(-)，2～3弱阳性为(+)，4～5中度阳性为(++)，6～7强阳性为(+++)；阴性为(-)，阳性为(+～+++)。

介入栓塞：在腹股沟区进行消毒铺巾，局麻后，采用Seldinger技术穿刺一侧股动脉，置导管鞘，在数字减影血管造影术透视下将Cobra 4-5F导管插入双侧骼内动脉造影，采用碘佛醇或碘比醇对比剂，在肿瘤血供后，操作侧动脉插管，导管成样后，进行同侧操作。按肿瘤供血分配比例灌注药物，瘤体滋养动脉栓塞，针对Ⅳa期直肠侵犯的病例加做肠系膜下动脉插管灌注化疗。栓塞治疗后，若进行造影复查时发现靶动脉封锁，未出现对比剂溢出，患者出血情况好转，患者血红蛋白指标上升，则视为栓塞有效。以顺铂为基础栓塞剂由直径1 mm的明胶海绵颗粒和丝裂霉素或表柔比星以及对比剂充分混合制成，用量依据肿瘤体积而定；透视监控下的栓塞，以不出现栓塞剂返流为宜。

癌组织中Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白阳性表达与介入栓塞治疗有效性的关系分析方法：总结可能影响介入栓塞治疗有效性的因素，包括性别、年龄、临床分期、肿瘤直径、分化程度、Notch1蛋白阳性表达、Hes-1蛋白阳性表达、CyclinD1蛋白阳性表达等，将其作为自变量，将介入栓塞治疗效果作为因变量，分析2种变量的临床关系。

1.3 观察指标

(1)恶性组与良性组Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表达。(2)恶性组介入栓塞的效果，完全缓解：肉眼观察目标肿块完全消退；目标肿块体积缩小50%以上为部分缓解；肿瘤病灶的两径乘积缩小不足50%或增大不超过25%为病情稳定；肿瘤病灶的两径乘积增大25%以上或者出现新病灶为病情进展。完全缓解和部分缓解记为有效[5]。(3)分析恶性组癌组织Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白阳性表达与介入栓塞治疗有效性的关系，统计介入栓塞治疗无效的影响因素，并记录各项因素的相对危险度(OR)及95%置信区间(95%CI)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 恶性组与良性组Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表达比较

恶性组与良性组Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表达对比差异有统计学意义(P<0.05)，恶性组Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白阳性表达率均高于良性组(P<0.05)，见表1、表2。

表1 恶性组与良性组Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表达对比(例，%)

2.2 统计恶性组介入栓塞的效果

恶性组完全缓解21例，部分缓解30例，病情稳定27例，病情进展20例，恶性组以顺铂为基础的子宫动脉介入栓塞无效率为47.96%(47/98)。

表2 恶性组与良性组Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白阳性表达率(例,%)

2.3 恶性组癌组织Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白阳性表达与介入栓塞治疗有效性的关系

≥Ⅲb期、肿瘤直径、未/低分化、癌组织Notch1蛋白阳性表达、癌组织Hes-1蛋白阳性表达、癌组织CyclinD1蛋白阳性表达均是影响恶性组介入栓塞治疗效果的危险因素(P<0.05)，见表3，表4。

表3 恶性组介入栓塞治疗效果的可能因素对比(例，%)

表4 恶性组介入栓塞治疗效果的影响因素Logistic多元回归分析

3 讨论

LACC狭义的概念是指癌灶直径≥4 cm的早期宫颈癌，由于肿瘤的体积较大，没有经过术前的治疗而进行手术，可能会导致病灶残留，并且会出现较高的淋巴结转移及并发症发生率。目前宫颈癌获得治愈最有效的方法是手术根治性切除，其可以提高患者的远期生存率，而对于局部肿块伴有周围浸润以及淋巴结转移的患者，往往会出现术后治疗无效的情况。本研究发现以顺铂为基础的子宫动脉介入栓塞无效率为47.96%，与刘保清等的报道结果接近[6]，提示以顺铂为基础的子宫动脉介入栓塞治疗效果不佳，因此需要进一步探讨影响介入栓塞治疗无效的因素。

本研究发现恶性组Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白阳性表达率均高于良性组，提示在LACC患者中Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白阳性表达偏高。Notch是一种信号通路蛋白，可以通过氧化反应，进而合成一种限速酶类，增加花生四烯酸合成前列腺素的速度。有研究指出，Notch1在宫颈癌患者机体生理病变中发挥着重要的作用[7]。Hes-1、CyclinD1蛋白能够影响癌症细胞的活性，并且进一步增强癌细胞的迁移侵袭能力。有研究表明[8]Hes-1、CyclinD1蛋白可调动蛋白水平，以调节宫颈癌细胞恶化程度。Notch受体与邻近的相应配体结合，进一步改变Notch受体胞外段结构，通过释放胞外段，从而使Notch受体的胞外段与包内部分离，Notch的包内段在蛋白酶复合体催化作用下分解，并且转移到细胞核内转录，抑制因子相结合，进而影响激活转录活性，调节靶基因(如Hes)等的转录表达，抑制下游基因转录[9]。有研究指出[10]，Notch信号通路能够调控人体内正常细胞的增殖以及分化，与一些肿瘤的发生息息相关，并且为肿瘤细胞的转移和扩散提供了可靠的依据。本研究与上述相关报道和分析相符。

本研究还发现，癌组织Notch1蛋白阳性表达、癌组织Hes-1蛋白阳性表达、癌组织CyclinD1蛋白阳性表达是介入栓塞治疗无效的影响因素。Notch1蛋白在人体肿瘤细胞的分化凋亡增殖过程中发挥着重要的作用，当蛋白持续异常表达时，细胞则会出现异常分化，导致过度增殖，进一步形成肿瘤。有研究表明[11]，Notch1能够解除细胞生长的抑制，进一步促进宫颈癌肿瘤细胞的生长。Notch1蛋白通过互补协同的方式影响肿瘤细胞的生长，促进新生血管的形成。Hes作为一种具有螺旋结构的转录因子，可以调节人体干细胞的分化。在脊椎动物中，Hes-1蛋白表达最为广泛，可以抑制靶基因的转录，在特定分化效应基因的启动子上发挥着重要的作用。Hes-1蛋白的表达受Notch信号的调节，也是Notch信号通路中最为重要的下游靶基因，影响以顺铂为基础的子宫动脉介入性栓塞的有效性[12]。CyclinD1作为周期素家族中的主要成员，其基因定位在染色体上，由295氨基酸组成，与周期蛋白依赖性激酶(CDK)、成视网膜母细胞瘤蛋白(PRb)蛋白相结合，共同形成氨基酸序列。体外实验证明，CyclinD1蛋白通过结合并激活周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)，使后者催化一系列关键底物，释放转录因子，促进DNA合成，促进宫颈癌细胞加速增殖[13]。因此，CyclinD1表达使CDK4、CDK6对PRb调节失常，导致细胞的生长和肿瘤的发展。因此在临床实践中针对LACC患者应积极控制上述危险因素，采取积极有效措施，抑制细胞生长和肿瘤的发展。

本研究还发现，≥Ⅲb期、肿瘤直径、未/低分化也是恶性组介入栓塞无效的危险因素，提示≥Ⅲb期、肿瘤直径、未/低分化也是介入栓塞治疗无效的影响因素。有研究指出[14]，以顺铂为基础的子宫动脉介入栓塞与患者分期、肿瘤直径、未/低分化等临床特征显著相关。顺铂在当前的人类肿瘤的治疗中发挥了重要的作用，同时，LACC的化疗药物也离不开顺铂通过诱导细胞死亡来抑制Notch信号进一步影响子宫动脉介入栓塞的效果[15]。对于LACC诊断及后期干预治疗，应该结合患者临床资料、肿瘤分期或临床病理分期，判定治疗后病情是否存在恶化，并根据≥Ⅲb期、肿瘤直径、未/低分化的变化情况及时更换预后的治疗干预方式。

综上所述，LACC患者中Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白阳性表达率高，Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白表达状态可能成为预测局部晚期宫颈癌同步放化疗预后的分子生物学指标。以顺铂为基础的子宫动脉介入栓塞治疗效果不佳，≥Ⅲb期、肿瘤直径、未/低分化、Notch1、Hes-1、CyclinD1蛋白阳性表达均是LACC介入栓塞无效的危险因素，因此针对LACC患者应及时检测Notch信号通路不同蛋白表达情况，预测介入栓塞的有效性。