非小细胞肺癌肿瘤微环境中NK细胞和TAMs的分布特点

张兰兰，毛志远，李向敏，李 燕，于海燕，晋 颖，夏秀玲，樊再雯

肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率、病死率呈逐年升高的趋势，其中非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的85%[1]。近年来有研究报道，肿瘤细胞和肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）共同影响肿瘤的侵袭和转移[2]。TME由内皮细胞、成纤维细胞和浸润性免疫细胞等组成，TME中的免疫细胞包括T细胞、B细胞、树突细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、中性粒细胞和骨髓来源的抑制细胞等[2]。与CD8+T细胞、B细胞等适应性免疫细胞不同，NK细胞和巨噬细胞是2种主要杀伤肿瘤细胞的固有免疫细胞，为了探讨NSCLC患者TME中NK细胞和TAMs的分布特点，本研究检测了87例NSCLC患者组织标本中CD56、CD68和CD163蛋白的表达，进一步探讨肿瘤微环境与患者临床特征及预后的关系，为肺癌术后患者的治疗方案提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2016年1月—2018年12月在空军特色医学中心（原空军总医院）手术切除，经病理学证实为NSCLC且临床资料完整的患者87例。根据Chen等[3]研究定义肿瘤微环境免疫分型（tumor micro-enviroment type，TMIT），TMIT Ⅰ型：CD8+PD-L1+；TMIT Ⅱ型：CD8-PD-L1-；TMIT Ⅲ型：CD8-PD-L1+；TMIT Ⅳ型：CD8+PD-L1-。本研究TMIT分型在前期实验的基础上进行了补充及完善[4]。所有患者术前均未接受过治疗，并且无其他恶性肿瘤、自身免疫性疾病及严重感染性疾病，样本收集及研究方案得到医院伦理委员会审核，所有参与患者或家属均告知并签署知情同意书，随访方式主要以电话、门诊、住院等对患者进行随访，随访时间截止2020年10月。

1.2 主要试剂 CD56抗体试剂（ZM-0057）、CD68抗体试剂（ZM-0060）、CD163抗体试剂（ZM-0428）、通用二步法试剂盒（PV-9000）、DAB显色试剂盒（ZLI-9018）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学链霉菌抗生物蛋白-过氧化物酶连接（streptavidin-perosidase，SP）方法 石蜡组织4 μm连续切片，捞于防脱片上，于65 ℃烤箱烘烤1～2 h脱蜡，切片置于pH 6.0柠檬酸缓冲液进行抗原修复，置入3% H2O2室温孵育15 min封闭抗原，滴加一抗（CD56抗体1：200，CD68抗体1：200，CD163抗体1：400），置于试剂盒中37 ℃ 30 min；PBS冲洗5次，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育30 min；PBS冲洗后二氨基联苯胺(3，3-diaminobezidin，DAB)显色，洗涤，苏木精复染，脱水，透明，自动封片机下封片，镜下观察。阴性对照：用PBS代替一抗。

1.4 结果判读标准 染色后所有切片由2位病理科医师按双盲法进行读片，选取5个具有代表性的视野。判断结果：CD56 阳性染色位于细胞膜和/或细胞质，按照染色强度计分，未染色计为0分、淡黄色计为1分、棕黄色计为2分、棕褐色计为3分；按阳性细胞染色比例计分，未染色计为0分、阳性细胞＜25%计为1分、25%～50%计为2分、＞50%计为3分。两项积分相乘，0分为阴性、≥1分为阳性[5]。CD68标记的TAMs以细胞质呈现棕黄色为阳性表达，CD163标记的M2型TAMs以细胞的胞质或胞膜呈现棕黄色为阳性表达，判定标准：根据TAMs浸润密度进行评分，即每视野内阳性细胞数占所有细胞数的50%；≥50%的阳性细胞为高浸润，＜50%的阳性细胞数为低浸润。TAMs浸润肿瘤微环境间质区域定义为边缘型巨噬细胞，TAMs浸润至癌巢中心部位定义为中心型巨噬细胞。

1.5 统计学处理 应用SPSS 25.0 软件对数据进行分析，率的比较应用χ2检验，应用Kaplan-Meier绘制生存曲线，单因素分析用Log-rank检验，以COX回归进行多因素生存分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征 87例中男53例（60.92%），女34例（39.0 8%）。年龄39～84岁。有吸烟史者39 例（44.83%），无吸烟史者48例（55.17%）。TNM分期：Ⅰ期45例（51.72%），Ⅱ期19例（21.84%），Ⅲ期23例（26.44%）。腺癌58例（66.67%），鳞癌29例（33.33%）。EGFR突变者35例（40.23%），EGFR野生型52例（59.17%）。TMIT分型结果：TMIT Ⅰ型29例（33.33%），TMIT Ⅱ型12例（13.79%），TMIT Ⅲ型 11例（12.64%），TMIT Ⅳ型35例（40.23%）。

2.2 CD56、CD68和CD163蛋白在NSCLC中的表达特点及其与临床病理学因素分析 CD56+NK细胞阳性表达27例（31.03%），阴性表达60例（68.97%）。CD56+NK细胞主要表达在肿瘤间质，癌巢几乎没有CD56+NK细胞（图1）。CD56+NK细胞在Ⅲ期、EGFR野生型的NSCLC组织中高表达（P＜0.05）。CD68+TAMs与CD163+TAMs在肿瘤间质与癌巢中心中均有浸润（图2、3），边缘型和中心型CD68+TAMs在Ⅲ期的NSCLC组织中高浸润（P＜0.05）。边缘型CD163+TAMs在Ⅲ期、腺癌的NSCLC患者组织中高浸润（P＜0.05）；中心型CD163+TAMs在吸烟、腺癌、Ⅲ期、EGFR野生型的NSCLC患者组织中高浸润（P＜0.05），在性别、年龄和TMIT分型的NSCLC组织中表达差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 CD56+NK 细胞、CD68+TAMs和CD163+TAMs表达与NSCLC患者临床病理学因素分析（例）

图1 CD56+NK细胞在NSCLC患者组织中免疫组化的检测结果（SP，×400）

图2 CD68+TAMs在NSCLC患者组织中免疫组化的检测结果（SP，×400）

2.3 CD56、CD68和CD163蛋白表达与NSCLC患者DFS相关性分析 截至2020年10月随访结束，87例中44例术后复发，中位无病生存期（disease free survival，DFS）为43.0个月。经Log-rank单因素分析显示，边缘型CD68+TAMs高浸润、边缘型CD163+TAMs高浸润的NSCLC患者的DFS较短（P＜0.05）（图4、5）。将所有指标纳入COX模型进行多因素回归分析，边缘型CD163+TAMs高浸润是影响DFS的独立危险因素（P＜0.05）。

图3 CD163+TAMs在NSCLC患者组织中免疫组化的检测结果（SP，×400）

图4 边缘型CD68+TAMs不同浸润程度与NSCLC患者生存曲线

图5 边缘型CD163+TAMs不同浸润程度与NSCLC患者生存曲线

3 讨论

TME是一个复杂的环境，在肿瘤细胞的周围有免疫细胞、间质细胞、成纤维细胞等各种细胞和丰富的细胞因子，这些物质形成一个具有缺氧、慢性炎症和免疫抑制性的TME[2]。多数免疫细胞的功能在TME中发生改变，如NK细胞不能发挥直接杀伤肿瘤细胞的功能[6]，TAMs也不能发挥有效的吞噬异己的能力，甚至发生极化，其中发生极化的M2型TAMs有促进肿瘤转移的能力，有研究发现M2型TAMs与新生血管和微淋巴管密度相关[7-8]，可能是TAMs分泌的物质刺激肿瘤细胞的增殖和转移[9]。多种癌症均有报道，TAMs的高浸润影响患者预后，如非小细胞肺癌、胃癌和乳腺癌等[10-12]。NK细胞的亚群在细胞毒性、细胞因子产生和归巢能力方面表现出功能差异，根据NK细胞表面CD56的表达水平，NK细胞分为CD56bright和CD56dim 2种不同的表型：CD56bright NK细胞具有产生丰富细胞因子的能力，而CD56dim NK细胞具有较强的细胞毒性[13]。有研究发现，肺内约10%～20%的淋巴细胞为NK细胞，绝大多数NK细胞为CD56dim表型[14-15]，故本研究选取CD56做为NK细胞的标记物。以往研究仅对CD68进行免疫染色，CD68是最常见的泛巨噬细胞标志物[16-17]。TAMs可分化成不同的表型，如抑制肿瘤的M1型巨噬细胞和促进肿瘤的M2型巨噬细胞[7]。M2型TAMs主要表达CD163蛋白、CD204蛋白和CD206蛋白[18-19]，故本研究选择CD68抗体和CD163抗体作为研究TAMs的指标。有研究报道，巨噬细胞分布在肺癌组织的不同区域中，如在癌组织与间质组织中的TAMs可能表现出不同的生物学特性[20-21]。本研究主要观察CD56+NK细胞、CD68+TAMs和CD163+TAMs在NSCLC肿瘤组织的分布。

本研究结果显示，NSCLC组织中CD56+NK细胞多数呈阴性表达，EGFR野生型NSCLC肿瘤间质高浸润，与既往研究结果相似[22-23]。首先，可能是NK细胞数量少，NK细胞在NSCLC癌组织和肿瘤间质之间分布呈显著的异质性，癌组织中心区几乎没有NK细胞，而在肿瘤间质中NK细胞也呈选择性地分布[23]；其次，NK细胞在TME中受到免疫抑制作用，肿瘤细胞分泌的细胞因子能抑制NK细胞的功能，如IL-6、IL-10、转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、吲哚胺-2，3-双加氧酶（idoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）等[24]。本研究未发现NK细胞对DFS的影响，但有研究发现在胃癌组织中NK细胞高浸润的患者化疗预后较好[25]，考虑肺癌与胃癌存在生物学差异以及样本量的关系，有待于进一步扩大样本量和纳入不同肿瘤进一步研究；也有研究认为影响患者生存的是NK细胞的表型和功能，而不是NK细胞的浸润密度[23]。

本研究Ⅲ期的NSCLC患者，其边缘型和中心型CD68+TAMs呈高浸润，可能是肿瘤细胞与CD68+TAMs能够通过旁分泌细胞因子形成旁分泌环，为NSCLC的侵袭和疾病进展提供了适宜的微环境[26-27]。边缘型CD163+TAMs在Ⅲ期、腺癌的NSCLC组织中以高浸润多见，可能是腺癌和鳞癌的TME之间存在差异性造成的。中心型CD163+TAMs在Ⅲ期、吸烟、EGFR野生型的NSCLC患者中高浸润。吸烟患者CD163+TAMs高浸润，可能是烟草能刺激多种免疫细胞浸润，包括中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞等[28]。一项研究报道，EGFR野生型NSCLC患者肿瘤间质的TAMs计数更高[29]，而另一项研究中心型CD204+（M2型）TAMs在EGFR野生型的NSCLC患者中低浸润[30]，可能是EGFR野生型与肿瘤中的巨噬细胞迁移有关，但其机制尚需进一步研究明确。

边缘型CD68+TAMs、CD163+TAMs高浸润的NSCLC患者DFS较短，在COX回归模型的多因素分析中，发现边缘型CD163+TAMs是影响DFS的独立危险因素。可能是早期肺癌患者的TME中M2型TAMs数量较少，CD68+TAMs在NSCLC进展期间可分化为CD163+TAMs促进肿瘤的侵袭性，且M2型TAMs主要分布于肿瘤间质，随着病情的进展可移入癌巢，故CD163是一个较CD68预测NSCLC患者预后更佳的指标。

在本研究纳入了免疫分型四分型法，未发现NK细胞、TAMs与免疫分型的相关性，可能是TME中存在多种免疫细胞，需要纳入更多的免疫细胞共同定义TME的性质。

综上所述，NSCLC患者TME中的NK细胞数量少，可能是肺癌微环境对NK细胞有抑制作用，导致其数量和比例明显下降。CD163+TAMs较CD68+TAMs更能反映TME具有免疫抑制性。对于边缘型和中心型CD163+TAMs高浸润的肿瘤患者，即使是早期患者，可能也需要术后辅助化疗或靶向治疗。本研究样本量较小，故下一步将进行大样本量的统计，并且完善国内外文献中涉及而本研究未完成的统计，以此为了解NSCLC肿瘤微环境中免疫细胞的分布特点，并进一步探索其临床意义。