重组人干扰素α2b 单克隆抗体亲和层析介质的制备及其纯化效果评价

顾建阳，王宇，孙子琪，张雯雯，常军亮

长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春 130012

干扰素（interferon，IFN）是宿主天然免疫中的一类多功能细胞炎症因子，具有广谱抗病毒、调节细胞生长分化和机体免疫功能的作用［1-4］。重组人干扰素α2b（recombinant human interferon α2b，rhIFNα2b）在临床抗病毒治疗中疗效明显，对慢性肝炎、带状疱疹、病毒性子宫颈糜烂等具有显著的治疗效果［5-7］，也广泛应用于新型冠状病毒肺炎的治疗［8-9］。

长春生物制品研究所有限责任公司（以下简称长春公司）在注射用rhIFNα2b 原液生产基础上研发了大规格卡式瓶液体制剂，与传统冻干粉针剂型相比，在药品质量和用药便捷程度上具有明显优势。对两种剂型理化稳定性、药效一致性等比对研究中，需要将样品进行前处理，即分离提取rhIFNα2b 蛋白及其相关物质以进行蛋白异质性、降解产物和生物有效性分析。从成品制剂中分离目的蛋白最有效的方法为亲和层析法，其中单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）亲和层析的特异性高、载量大、流速快、蛋白活性损伤程度低等特点使其成为优选方法。用于偶联的McAb 对rhIFNα2b 及其相关物质的吸附特性是样品前处理中最关键的环节。本研究筛选制备rhIFNα2b 的McAb，并验证其与rhIFNα2b 及其蛋白聚体的特异性反应，再偶联至CNBr 预活化的琼脂糖凝胶介质，评价该介质的纯化效果，以期为rhIFNα2b 剂型质量比对样品前处理提供可靠的纯化方法。

1 材料与方法

1.1原液 rhIFNα2b 原液（批号为：B20190501）由长春公司细胞因子室提供。

1.2细胞株 小鼠骨髓瘤NS-1 细胞由长春公司生物技术研究室保存。

1.3实验动物 SPF 级BALB ／ c 小鼠，雌性，体重16 ～18 g，由长春公司实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（吉）-2017-0005。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照长春公司实验动物福利与伦理委员会章程规定进行。

1.4主要试剂及仪器 RMPI1640 培养基（Cat：05918）购自日本日水制药公司；胎牛血清（CellMax）购自兰州民海生物工程有限公司；弗氏佐剂、HAT、HT、PEG4000 及降植烷均购自美国Sigma 公司；HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；增强型DAB 显色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；浓盐酸、冰醋酸、碳酸氢钠、氯化钠及三羟甲基氨基甲烷等化学试剂（均为分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；BXK16 ／ 20 层析柱（Cat：B-1620）、CNBr-activated BestaroseTM4FF（Cat：AA017912）及AT Protein A Diamond（Cat：AA0273）均购自上海博格隆生物技术有限公司。

1.5rhIFNα2b热加速样品的制备及检测 将rhIFNα2b原液于56 ℃热加速处理2、4、6、8、24、30 h，取样，经15%非还原型SDS-PAGE 分析。

1.6rhIFNα2bMcAb 杂交瘤细胞筛选 将rhIFNα2b原液与弗氏完全佐剂等体积充分乳化后，经小鼠背部皮下多点免疫，100 μg ／ 只。将rhIFNα2b 原液与弗氏不完全佐剂等体积充分乳化，初次免疫后每间隔10 d 进行1 次免疫，免疫剂量及途径同上，共免疫3 次；融合前3 d，经小鼠尾静脉进行加强免疫，200 μg ／ 只。采用常规PEG4000 化学法进行细胞融合［10］，间接ELISA 法检测融合及阳性克隆细胞孔上清特异性抗体，有限稀释法对阳性克隆孔杂交瘤细胞进行单克隆筛选。

1.7McAb 的制备及鉴定 采用小鼠体内诱生法制备McAb 腹水［11］，腹水经饱和硫酸铵（50%和33%）分级沉淀粗纯后，用AT Protein A 亲和层析进行纯化；经12%还原型SDS-PAGE 鉴定纯化McAb 的纯度；Western blot 法鉴定McAb 与rhIFNα2b 及其聚合蛋白的特异性反应［12］，rhIFNα2b 及其聚合蛋白上样量均为15 μg；以筛选的抗rhIFNα2b McAb（1.0 mg／mL）作为一抗，稀释度为1 ∶1 000；以HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 作为二抗，稀释度为1 ∶2 000。

1.8McAb亲和层析介质的制备 将McAb用0.1mol／L Na2CO3+ 0.5 mol ／ L NaCl（pH 8.3）溶液，于2 ～8 ℃平衡16 h，紫外-可见分光光度法测定蛋白浓度。用2 ～8 ℃预冷的1.0 mmol ／ L HCl 与CNBr-activated BestaroseTM4FF 凝胶按100 ∶1 的体积比混悬，洗涤5 次，静置沉降，去上清，即为预活化介质。用0.5倍体积1.0 mmol ／ L HCl 分散预活化介质，与预平衡McAb 等体积混合，于20 ℃，100 r ／ min 振摇偶联［6］，每隔1 h 取上清和凝胶样本，至4 h。紫外-可见分光光度法测定上清McAb 蛋白浓度，12%还原型SDS-PAGE 验证凝胶抗体蛋白偶联程度。待上清蛋白浓度不再下降后，于2 ～8 ℃静置过夜，使其充分偶联。

1.9偶联介质亲和效果验证 根据上清蛋白浓度计算预活化凝胶对McAb 的最大偶联量；凝胶沉淀用5 倍体积封闭液（0.1 mol ／ L Tris-HCl，pH 8.3）洗涤1 次，再用5 倍体积封闭液于20 ℃，100 r ／ min 振摇封闭5 h；5 倍体积的封闭液和0.2 mol ／ L 醋酸交替清洗偶联介质5 次，5 min ／ 次；用20 mmol ／ L PBS（pH 7.0）溶液洗涤，2 ～8 ℃保存备用。将McAb偶联亲和层析介质填装BXK16 ／ 20 层析柱，柱床体积6 mL，以20 mmol ／ L PBS（pH 7.0）+ 0.5%吐温20 为平衡液，5 mL ／ min 流速淋洗柱床5 个体积；以0.1 mol ／ L GLY-HCl（pH 3.0）缓冲液为洗脱液，对rhIFNα2b 原液及56 ℃热加速24 h 样品进行上样吸附和洗脱，洗脱样品进行15%非还原型SDS-PAGE 和Western blot 检测（同1.7 项）。

2 结 果

2.1rhIFNα2b 热处理样品的鉴定 rhIFNα2b 原液经56 ℃热加速24 h 后，可产生明显蛋白聚体，见图1。

图1 rhIFNα2b 原液经56 ℃热加速处理样品的非还原SDS-PAGE 分析Fig.1 Non-reduced SDS-PAGE profile of bulk of rhIFNα2b treated by accelerated heating at 56 ℃

2.2McAb 的筛选及纯化产物的鉴定 经杂交瘤制备和筛选，确定以4E2 抗体作为偶联McAb，其AT Protein A 亲和层析纯化产物经12%还原型SDS-PAGE 分析，可见相对分子质量约50 000 和25 000 的目的蛋白条带，大小与预期相符，纯度> 95%，见图2；且可与rhIFNα2b 及其蛋白聚体发生特异性反应，见图3。

图2 亲和层析纯化McAb 4E2 的还原型SDS-PAGE 分析Fig.2 Reduced SDS-PAGE profile of McAb 4E2 purified by affinity chromatography

图3 亲和层析纯化McAb 4E2 的Western blot 检测Fig.3 Western blotting of McAb 4E2 purified by affinity chromatography

2.3最适McAb 偶联时间 平衡后McAb 4E2 的浓度为35 mg ／ mL，与CNBr-activated BestaroseTM4FF 偶联0、1、2、3、4 h 时，上清的抗体蛋白浓度分别为16.91、4.14、2.68、2.48、2.51 mg ／ mL。3 h 后抗体蛋白浓度趋于平稳，换算预活化凝胶介质抗体蛋白吸附率约为30 mg ／ mL，此时凝胶介质偶联抗体蛋白量趋于饱和，见图4。为使偶联更加充分，确定最佳偶联时间为4 h。

图4 不同偶联时间凝胶样品的还原型SDS-PAGE 分析Fig.4 Reduced SDS-PAGE profile of McAb coupled to CNBr-activated BestaroseTM 4FF for various hours

2.4偶联介质亲和效果验证 rhIFNα2b 原液及其56 ℃热加速24 h 样品的McAb 亲和层析柱洗脱产物经15%非还原SDS-PAGE 分析，可见rhIFNα2b 单体及蛋白聚体条带，与洗脱前一致，见图5；且均可与纯化4E2 McAb 发生特异性结合，见图6。表明偶联介质可有效吸附rhIFNα2b 及其蛋白聚体，且洗脱样品保持与McAb 结合活性。

图5 McAb 亲和层析纯化样品的非还原SDS-PAGE 分析Fig.5 Non-reduced SDS-PAGE profile of McAb purified by affinity chromatography

图6 McAb 亲和层析纯化样品的Western blot 检测Fig.6 Western blotting of McAb purified by affinity chromatography

3 讨 论

rhIFN 药物在长期临床使用过程中，为病毒感染性疾病的治疗和预防、免疫系统的调节和抗肿瘤作用等提供了多种有效干预手段，临床疗效显著［13-14］。由于早期蛋白质纯化技术的限制，初期上市rhIFN 制品多采用小鼠McAb 亲和层析方法进行纯化，价格昂贵，但其在特异性、载量、收率方面均具有明显优势［15-16］。本研究制备的rhIFNα2b McAb 亲和层析介质在长春公司rhIFNα2b 冻干注射剂与大规格卡式瓶制剂稳定性比对的样品前处理过程中得到有效应用，对制备的rhIFNα2b 进行异质性蛋白、降解产物、修饰产物和生物有效性差异的检测能够较全面真实地反映剂型中目的蛋白及其相关物质的天然状态，也间接表明该亲和层析介质的良好性能［17］。

偶联McAb 的生物特性决定了McAb 亲和层析介质的性能，其亲和力过高，所吸附目的蛋白难以洗脱；若识别结合表位过于保守，则难以全面吸附相关蛋白。本研究结果表明，筛选的小鼠McAb 4E2 对rhIFNα2b 蛋白及其聚体蛋白具有广谱结合性，且用于填装层析柱后，在纯化缓冲体系中能够确保目的蛋白充分吸附和洗脱，并保持洗脱样品蛋白谱完整性及与McAb 的结合活性。CNBr 预活化的琼脂糖介质可将含伯氨基（-NH2）的多种类型蛋白偶联至该介质上［18］，而采用含伯氨基的小分子盐类（Tris）进行封闭可降低对目的蛋白的非特异性吸附。本研究对抗体蛋白偶联优化时间结果显示，偶练3 h 后可达饱和，4 h 可使封闭更完全，因此确定4 h 为最适偶联时间。

目前，虽然McAb 亲和层析法在多种药物制备工艺中已被替代，但在药物分析小量样品处理方面仍具有不可替代的地位。本研究对rhIFNα2b 及其他重组蛋白药物研究分析提供了参考。