NLRP3 抑制剂MCC950 对中性粒细胞性哮喘气道炎症的影响及其作用机制

陈凌，茅松，朱若尘，徐敏，吴良霞，石文静

上海交通大学附属第六人民医院儿科，上海 200233

支气管哮喘（简称哮喘）是常见的慢性气道炎症性疾病，近年发病率逐年升高，现已成为全球性公共健康问题。据统计，目前全球已有超过3 亿哮喘患者，其中儿童发病率呈快速增长趋势［1-2］。糖皮质激素是哮喘治疗一线用药，可有效缓解哮喘患者的临床症状，但仍有部分患者对激素治疗不敏感，病情未得到良好控制［3］。对哮喘发病机制的深入研究发现，激素不敏感及重症哮喘患者的气道炎症多以中性粒细胞浸润为主，这类患者的外周血、痰液及肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的中性粒细胞数量、Th17 细胞数量及IL-17A、IL-17F 等炎症因子的表达水平均明显升高，且与疾病严重程度密切相关［4-5］。

Th17 细胞主要分泌IL-17A、IL-17F 等细胞因子，其分化过程受多种因素调［6］。T 淋巴细胞分化初期，在转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）和IL-6 的共同作用下，通过磷酸化STAT-3 途径，诱导转录因子维A 酸相关孤儿受体（retinoid-related orphan receptor-gamma-t，RORγt）表达，从而促进Th0细胞向Th17 细胞分化［7］。近年研究发现，含热蛋白结构域3 的富含亮氨酸重复序列的核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerization domainleucine-rich repeats containing pyrin domain 3，NLRP3）信号通路及下游因子IL-1β 也参与Th17 细胞的调控［8-9］。Th17 细胞分泌的主要细胞因子IL-17A 通过作用靶细胞分泌IL-6、粒细胞-巨细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF）、TNF-α 等炎症因子，募集及活化中性粒细胞，参与气道炎症反应［10-11］。另有报道指出，NLRP3 炎症小体及下游因子IL-1β、IL-18 在哮喘肺组织高表达［12］，可见NLRP3 ／ IL-1β ／ IL-17A 信号通路在哮喘气道炎症形成过程中可能发挥十分重要的作用。因此推测，抑制NLRP3 的活化可能减轻中性粒细胞性哮喘气道炎症反应及气道损伤。

NLRP3 蛋白是NOD 样受体（NOD-like receptor，NLR）家族中最重要成员之一，其与凋亡相关点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1的前体（procysteinyl aspartate specific proteinase 1，procaspase-1）组成大分子炎症小体，其具有广泛的免疫调节和抗微生物作用，与自身免疫性疾病和感染性疾的发生病密切相关［13-14］。MCC950 为新发现的NLRP3抑制剂，可特异性抑制NLRP3 炎症小体的活化，从而发挥抗炎作用。本研究通过建立中性粒细胞性哮喘动物模型，观察MCC950 在动物体内对中性粒细胞性哮喘的作用，并探讨相关机制，以期为此类哮喘的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、完全弗氏佐剂（complete Freund adjuvant，CFA）及MCC950均购自美国Sigma 公司；RNAlater 及PowerUpTMSYBRTMGreen 预混液均购自美国Thermo Fisher 公司；小鼠IL-18 ELISA 试剂盒购自中国MultiSciences 公司；IL-17A 及IL-1β ELISA 试剂盒购自美国eBioscience 公司；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）测试盒（比色法）购自南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTMⅣ1st strand cDNA Synthesis Mix 及TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 均购自日本TaKaRa 公司。

1.2实验动物 SPF 级BALB ／ c 小鼠，雌性，6 ～8周龄，体重16 ～18 g，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，动物许可证号为：SCXK（沪）2018-0006。小鼠均饲养于上海交通大学附属第六人民医院动物实验中心屏障系统内。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照上海市第六人民医院动物伦理相关规定进行（文件号为：2020-0074）。

1.3动物分组及给药 将小鼠随机分为PBS 对照组、中性粒细胞性哮喘组（NA 组）、干预组（MCC950 组），每组6 只。NA 组小鼠于第0 天经皮下注射20 μg OVA、75 μL CFA、25 μL PBS 的混合液，第21 及22 天均以1% OVA 的混悬液雾化吸入激发10 min［15］；MCC950 组小鼠处理同NA 组，于雾化吸入前连续3 d经腹腔注射MCC950，50 μg ／ g 体重；PBS 对照组小鼠于相同时间点给予相同剂量PBS 经皮下／ 腹腔注射或雾化吸入。

1.4小鼠气道高反应性检测 末次雾化结束后，小鼠清醒状态下，采用有创肺功能仪检测小鼠自主呼吸，依次用3.125、6.25、12.5、25、50 mg／mL 浓度的醋甲胆碱雾化3 min，间隔2 min，连续监测并记录5 min。采用生物记录仪测定小鼠气道气流和压力变化，计算小鼠肺通气阻力值。

1.5MCC950 对小鼠BALF 中炎性细胞总数及细胞分类计数影响的检测 末次雾化24 h 后，用3%戊巴比妥过量麻醉，经气管插管行肺泡灌洗，400 μL 生理盐水灌洗全肺，重复3 次，回收BALF 约1.0 mL，4 000 ×g离心10 min，取上清，-80 ℃冻存；用0.9%氯化钠溶液将细胞沉淀重悬，用血球计数板计数，计算每毫升BALF 细胞总数，并涂片，Wright-Giemsa 染色，进行细胞分类计数。

1.6MCC950 对小鼠BALF 中IL-17A、IL-18 及IL-1β表达水平影响的检测 采用相应ELISA 试剂盒检测BALF 中IL-17A、IL-18 及IL-1β 的表达水平。

1.7MCC950 对各组小鼠BALF 中MPO 活力影响的测定 采用MPO 测试盒（比色法）检测各组小鼠BALF 中MPO 活力。

1.8MCC950 对小鼠肺组织NLRP3、caspase-1、IL-1β及RORγt基因mRNA 相对表达量影响的检测 按1.5 项处理小鼠，取左肺组织，置RNAlater 中，于-80 ℃冻存。根据GenBank 中登录的小鼠NLRP3、caspase-1、IL-1β、RORγt及GAPDH基因序列，应用Oligo 7.0 软件设计引物，引物序列见表1，由上海铂尚生物技术有限公司合成。用RNA 提取试剂盒提取各组小鼠肺组织总RNA，逆转录合成cDNA，以其为模板进行PCR 扩增。PCR 反应条件为：95 ℃2 min；95 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃60 s，共40 个循环。2-△△CT法计算mRNA 相对表达量。

1.9各组小鼠肺组织的病理分析 取1.8 项中各组小鼠的右肺组织，用4%多聚甲醛固定48 h，HE 染色，观察气道炎症细胞浸润情况。气道炎症评分为0 ～4 分：0 分表示支气管周围无炎症细胞浸润；1 分表示偶有袖套样炎症细胞浸润；2 分表示大部分的细支气管周围可见炎症细胞浸润，且为单层细胞包绕；3 分表示大部分细支气管周围可见炎症细胞浸润，且为2 ～4 层细胞包绕；4 分表示细支气管周围浸润炎症细胞层数超过4 层。每只动物观察3 张切片，每张切片随机选择5 个视野，取均数作为该动物的代表值，气道空腔和切片空白处面积不计算在内［16］。

1.10统计学分析 应用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析，试验结果均以均值±标准差（x±s）表示，多组间比较采用ANOVA分析，组间多重比采用Bonferroni检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1小鼠气道的高反应性 与PBS 对照组比较，在低浓度醋甲胆碱溶液（3.125 mg ／ mL）激发下，NA组小鼠肺通气阻力差异无统计学意义（t= 2.453，P＞0.05），高浓度醋甲胆碱溶液（6.25、12.5、25、50 mg ／ mL）激发下，NA 组小鼠气道阻力明显升高（t分别为3.324、5.871、16.910 和11.840，P均＜0.05）。在浓度为12.5、25、50 mg ／ mL 的醋甲胆碱溶液激发下，与NA 组比较，MCC950 组小鼠气道阻力明显降低（t分别为3.289、6.491 和5.402，P均＜0.05）。见图1。

2.2MCC950 对小鼠BALF 中炎性细胞总数及细胞分类计数的影响 各组小鼠BALF 中炎性细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数差异有统计学意义（F分别为174.2、384.3 和262.6，P均＜0.001）。与PBS 对照组比较，NA 组小鼠BALF 中炎性细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数、嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞数均明显升高（t分别为18.17、25.40、22.80、14.94和7.62，P均＜0.01）；与NA 组比较，MCC950 组小鼠BALF 中炎性细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞数及淋巴细胞数明显降低（t分别为12.79、22.31、13.39和4.28，P均＜0.05），见表2。表明NA 组小鼠气道炎性细胞浸润明显增多，以中性粒细胞为主；MCC950的干预显著降低了哮喘小鼠BALF 中炎症细胞的数量。

表2 各组小鼠BALF 中的炎性细胞总数及分类计数（× 103 个／ mL，± s，n = 6）Tab.2 Total and classified inflammatory cell counts in BALF of mice in various groups（× 103 cells ／ mL，± s，n = 6）

表2 各组小鼠BALF 中的炎性细胞总数及分类计数（× 103 个／ mL，± s，n = 6）Tab.2 Total and classified inflammatory cell counts in BALF of mice in various groups（× 103 cells ／ mL，± s，n = 6）

注：与PBS 对照组比较，aa 表示P ＜0.01，aaa 表示P ＜0.001；与NA 组比较，b 表示P ＜0.05，bb 表示P ＜0.01。

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2.3MCC950 对小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A、IL-18表达水平的影响 各组小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A和IL-18 的表达水平差异有统计学意义（F分别为54.63、636.1 和75.44，P均＜0.001），与PBS 对照组比较，NA 组小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A、IL-18 的表达水平均显著升高（t分别为10.37、35.44 和12.01，P均＜0.001）；与NA 组比较，MCC950 组小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A 及IL-18 表达水平明显降低（t分别为6.302、21.200 和8.231，P均＜0.01）。见表3。

表3 各组小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A、IL-18 的表达水平（pg ／ mL，± s，n = 6）Tab.3 Expression levels of IL-1β，IL-17A and IL-18 in BALF of mice in various groups（pg ／ mL，± s，n = 6）

表3 各组小鼠BALF 中IL-1β、IL-17A、IL-18 的表达水平（pg ／ mL，± s，n = 6）Tab.3 Expression levels of IL-1β，IL-17A and IL-18 in BALF of mice in various groups（pg ／ mL，± s，n = 6）

注：与PBS 对照组比较，aaa 表示P ＜0.001；与NA 组比较，bb 表示P ＜0.01。

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2.4MCC950 对小鼠BALF 中MPO 活力的影响PBS 对照组、NA 组、MCC950 组小鼠BALF 中MPO活力分别为65.94±10.68、215.00±16.46、151.30±11.43。与PBS 对照组比较，NA 组小鼠BALF 中MPO 活力明显升高（t= 13.92，P＜0.001）；与NA组比较，MCC950 组小鼠BALF 中MPO 活力明显降低（t= 3.945，P＜0.01）。

2.5MCC950 对小鼠肺组织NLRP3、caspase-1、IL-1β及RORγtmRNA 相对表达量的影响 各组小鼠肺组织NLRP3、IL-1β 及RORγtmRNA 相对表达量差异有统计学意义（F分别为64.78、51.93 和76.80，P均＜0.001）。与PBS 对照组比较，NA 组小鼠肺组织NLRP3、IL-1β、RORγtmRNA 相对表达量均显著升高（t分别为10.72、9.780 和12.37，P均＜0.01）；与NA组比较，MCC950 组小鼠肺组织IL-1β、RORγtmRNA相对表达量显著降低（t分别为7.373 和5.463，P均＜0.01），NLRP3、caspase-1mRNA 的相对表达量差异无统计学意义（t分别为2.047 和1.581，P均＞0.05）。见表4。

表4 各组小鼠肺组织NLRP3、caspase-1、IL-1β、RORγt 基因mRNA 的相对表达水平（± s，n = 6）Tab.4 Relative transcription levels of NLRP3，caspase-1，IL-1β and RORγt mRNAs in lung tissues of mice in various groups（± s，n = 6）

表4 各组小鼠肺组织NLRP3、caspase-1、IL-1β、RORγt 基因mRNA 的相对表达水平（± s，n = 6）Tab.4 Relative transcription levels of NLRP3，caspase-1，IL-1β and RORγt mRNAs in lung tissues of mice in various groups（± s，n = 6）

注：与PBS 对照组比较，aa 表示P ＜0.01，aaa 表示P ＜0.001；与NA 组比较，bb 表示P ＜0.01。

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2.6各组小鼠肺组织的病理分析 PBS 对照组、NA组、MCC950 组小鼠肺组织炎症指数分别为0.58 ±0.23、3.56 ± 0.38、2.57 ± 0.33。与PBS 对照组比较，NA 组小鼠支气管及小血管周围炎症细胞浸润明显增多，炎症指数明显升高（t= 11.43，P＜0.001）；与NA 组比较，MCC950 组小鼠肺组织内炎性细胞渗出明显减轻，炎症指数明显降低（t=3.816，P＜0.05）。见图2。

图2 各组小鼠肺组织病理切片的镜下观察（HE 染色，×400）Fig.2 Microscopy of histopathological sections of lung tissues of mice in varous groups（HE staining，× 400）

3 讨 论

哮喘是发病机制复杂，由多种细胞及细胞组分参与的慢性炎症性疾病，以气道炎性细胞浸润、气道高反应、黏液分泌增加及气道重塑为主要病理特征。有研究认为，嗜酸性粒细胞在气道内聚集和浸润是哮喘的主要炎症特征，随着对哮喘发病机制的深入研究，发现约50%成人哮喘和部分儿童哮喘表现为中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等参与的非嗜酸细胞性炎症，尤其是重症哮喘及激素抵抗型哮喘患者，多以中性粒细胞气道浸润为特征，且气道阻塞的可逆性较差，气道重塑也更为显著［17-18］。临床研究数据显示，诊断为重症哮喘的患者，除临床表现更为严重外，其外周血、痰液及BALF 中Th17 细胞的数量及IL-17A 的表达水平均明显升高［19-20］。另有研究指出，激素发挥抗炎作用需与细胞表面的糖皮质激素受体-α（glucocorticoid receptor-α，GR-α）结合；中性粒细胞表面主要表达GR-β，缺乏与激素结合的反应元件，是激素抵抗型哮喘的病理基础之一，IL-17A 除募集和活化中性粒细胞外，还可促进气道上皮细胞表达GR-β，同时抑制GR-α 的表达，进而影响激素治疗的敏感性［21-22］。因此，IL-17A 在以中性粒细胞气道炎症为表现的激素抵抗型哮喘的病理过程中发挥十分重要的促进作用。本研究采用OVA 联合CFA建立哮喘动物模型，结果显示，模型小鼠气道反应性明显增强，气道炎性渗出显著增加，BALF 细胞分类以中性粒细胞为主，且MPO 活性显著增强（P＜0.001），BALF 中IL-17A 表达水平明显升高（P＜0.001），肺组织中调控Th17 细胞的转录因子RORγtmRNA 表达也显著上调（P＜0.01），该结果与上述研究结论一致，符合中性粒细胞性哮喘气道炎症表现。

气道上皮细胞在哮喘炎症形成过程中发挥重要的调节作用，且哮喘疾病严重程度与气道上皮细胞的数量、功能密切相关。近来研究发现，NLRP3 在气道上皮细胞中表达，且在上皮细胞介导的炎症反应中发挥重要作用［23］。NLRP3 正常情况下处于非活化的抑制状态，受到病原微生物或危险信号等的刺激后活化，通过N-末端热蛋白结构域（pyrin domain，PYD）与ASC 结合，后者募集效应蛋白pro-caspase-1，从而相互作用形成炎症小体，促进caspase-1 成熟活化，进一步将pro-IL-1β、pro-IL-18 水解活化为成熟的IL-1β、IL-18 而发挥作用，参与调节免疫炎症反应［24-25］。本研究结果显示，与PBS 对照组比较，NA 组小鼠的BALF中IL-1β、IL-18 的表达均明显升高（P＜0.001），肺组织中NLRP3、NLRP3、IL-1β、RORγtmRNA 表达显著上调（P＜0.01）。IL-1 家族是固有免疫和获得性免疫反应的关键因子，IL-1β 作为该家族重要成员，是调节免疫炎症反应的重要介质，同时也是NLRP3 炎症小体下游调控的主要细胞因子，上述结果表明，OVA 诱导的哮喘动物模型中NLRP3 炎症小体被激活，促进了下游炎症因子的表达。有研究证实，IL-1β 与IL-6、TGF-β 协调作用，共同促进了Th17 细胞的分化成熟，Th17 细胞高表达IL-1 受体（IL-1R），而该受体的缺乏可导致IL-17A、IL-17F、IL-22 等炎症因子的分泌明显减少，因此，IL-1β 除了参与Th17 细胞的分化成熟过程外，对其分泌功能亦十分重要［26-27］。IL-17A作为Th17 细胞最重要的效应因子，通过诱导气道上皮细胞、平滑肌细胞分泌GM-CSF、CXC 趋化因子、IL-8 等炎症介质募集和活化中性粒细胞，促进气道炎症形成，同时IL-17A 促进中性粒细胞产生弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶-9 等，并促进表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）的表达及成纤维细胞的增殖和迁移，参与气道重塑过程［28-31］。由此可见，NLRP3 ／ IL-1β ／ IL-17A 信号通路在中性粒细胞性气道炎症形成中发挥重要促进作用，因此通过阻断或调控该通路，进而减轻哮喘的气道炎症反应及气道重塑，具有理论可行性。

MCC950 是选择性NLRP3 拮抗剂，能够显著抑制NLRP3 的活化，已应用于多种疾病的研究中［32-33］。本研究结果表明，与NA 组比较，MCC950 组小鼠的气道高反应性显著下降（P＜0.01），BALF 中炎性细胞总数、中性粒细胞比例、MPO 活力及IL-1β、IL-18、IL-17A 等炎症因子的表达均显著下调（P＜0.01）；HE 染色结果也显示，小鼠肺组织的支气管及小血管周围炎性细胞渗出显著减少。综上所述，MCC950 通过抑制NLRP3 的活化，干扰炎症小体的形成，从而减少下游细胞因子IL-1β、IL-18 的表达，并进一步通过干预Th17 细胞的分化成熟及其分泌功能，减少IL-17A等炎症因子的表达，抑制气道内中性粒细胞的募集和活化，有效减轻中性粒细胞性气道炎症，从而证实抑制NLRP3 ／ IL-1β ／ IL-17A 信号通路是减轻中性粒细胞性哮喘气道炎症反应的有效手段。实时荧光定量PCR 结果显示，IL-1β、RORγtmRNA 表达被显著抑制（P＜0.01），NLRP3、caspase-1mRNA 表达差异无统计学意义（P＞0.01），表明MCC950 可能仅调控NLRP3 的活化及影响其与ASC 和pro-caspase-1 的相互作用，并不抑制NLRP3 的表达［34］。NLRP3 炎症小体在哮喘疾病中的作用机制、抑制NLRP3 对效应细胞表达GR-α ／ β 的影响及Treg 细胞的功能由此受到影响等问题需进一步研究。

综上所述，本实验采用OVA 联合CFA 成功建立了以气道中性粒细胞浸润为特征的哮喘动物模型，初步探讨了NLRP3 抑制剂MCC950 在动物体内对NLRP3 ／ IL-1β ／ IL-17A 信号通路的调控作用及相关机制，证实了抑制NLRP3 的活化可有效减轻中性粒细胞性气道炎症反应。本实验为以中性粒细胞气道浸润为特征的重症哮喘及激素抵抗型哮喘的治疗提供了实验依据。