1 株柯萨奇病毒A 组10 型毒株在KMB17 细胞上的遗传稳定性分析

许丹菡，张捷，丛山日，张名，冯昌增，黄小琴，孙浩，杨昭庆，马绍辉

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南 昆明 650118

手足口病（hand，food and mouth disease，HFMD）是一种常见的病毒性儿童疾病。肠道病毒A 组71 型（enterovirus A71，EV-A71）和柯萨奇病毒A 组16 型（Coxsackie virus A16，CV-A16）是其主要的病原体。但近年来，柯萨奇病毒A 组10 型（CV-A10）已逐渐演变为HFMD 的主要病原体之一［1-13］。目前尚无针对HFMD 病原体的特异性药物，上市的EV-A71 疫苗对CV-A10 感染无交叉保护作用［11，14-15］。

CV-A10 属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属A群肠道病毒（enterovirus A，EV-A），其基因组为单股正链RNA，全长约7 500 nt。病毒编码的RNA 依赖的RNA 聚合酶缺乏校正功能，因此RNA 病毒复制具有突变率高的特性［16］。此外，对EV-A-D 基因组的分析显示，CV-A10 不如EV-A71、CV-A16、CV-A6基因稳定，重组频率更高［17］。《中国药典》三部（2020版）规定疫苗生产需建立种子批系统，力求生产使用的毒种能保持良好的遗传稳定性。人胚肺二倍体细胞（KMB17）是中国医学科学院医学生物学研究所自主开发建立的人源性细胞株，已经成功应用于多种上市疫苗的生产［18］。目前，针对KMB17 细胞CVA10 适应株的报道较少，相关研究不够深入。本研究对KMB17 细胞适应株K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017连续传代培养的遗传稳定性进行分析，为CV-A10 疫苗的研发奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1细胞及病毒 KMB17 细胞、人横纹肌肉瘤细胞（RD）及CV-A10 病毒株V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017［19］均由中国医学科学院医学生物学研究所遗传室保存，毒株V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 为非洲绿猴肾细胞（Vero）的第23 代适应株。

1.2主要试剂 Axygen Body Fluid Viral DNA ／ RNA Miniprep Kit 试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3KMB17 细胞适应株的连续传代培养 将V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 病毒液以1 MOI 感染KMB17细胞，至80%细胞出现病变效应（cytopathic effect，CPE）后，收获病毒液，反复冻融3 次，4 ℃，5 000 ×g离心30 min，取上清标记为新一代病毒，于-20 ℃储存。将病毒株第1 次接种KMB17 细胞后收获的病毒液记为第1 代，连续传至第15 代。检测各代次病毒滴度。

1.4病毒血清型鉴定 用Axygen Body Fluid Viral DNA ／ RNA Miniprep Kit 试剂盒提取病毒RNA，用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒并选择肠道病毒通用引物224 和222（引物序列见表1）对病毒的部分VP1 序列进行RT-PCR 扩增。反应体系：2×1 Step buffer 10 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.8 μL，上下游引物各1 μL，RNA 模板3 μL，无酶水4.2 μL。反应条件：50 ℃逆转录30 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃变性0.5 min，52 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸6 min，4 ℃保温10 min。阳性结果送北京擎科生物技术有限公司（昆明）测序，利用NCBI BLAST 比对测序结果，鉴定病毒血清型。

1.5病毒滴度检测 将病毒液10 倍梯度稀释（10-1～10-10），接种至96 孔微量培养板，100 μL ／ 孔，每个稀释度重复8 孔；将生长状态良好的RD 细胞消化为（1 ～2）× 105个／ mL 的细胞悬液，加至96 孔微量培养板，100 μL ／ 孔，设2 个纵排为正常细胞对照，置37 ℃，5% CO2培养箱培养；逐日观察并记录。孔中出现50% CPE 判定为阳性，7 d 后对结果进行最终统计。按照Reed Muench 法计算细胞培养半数感染量（cell culture infective dose 50%，CCID50）。

1.6各代次病毒全基因组测序及分析 取KMB17细胞适应前和适应后第5、10、15 代次的病毒液，提取RNA。根据文献［10］，利用Primer primer 5.0 软件设计引物（表1），引物由北京擎科生物技术有限公司（昆明）合成。使用引物EV1F 和CVA10-3R 以及CVA10-2F 和CVA10-8R 分段RT-PCR 扩增（反应体系和反应条件同1.4 项）CV-A10 全基因组序列。采用DNAStar Lasergene 7.1.0 软件拼接序列，Geneious 9.1.4 软件比对各代次全基因组序列以及核苷酸和氨基酸序列，Mega 7.0 软件进行系统进化分析。进化分析采用neighbor-joining 算法（参数：Test of Phylogeny 为Bootstrap method，No.of Bootstrap Replications 为1 000，Mode 为Kimura 2-parameter model），显示bootstrap 值大于70%。参考BIAN等［17］的分型方式，根据VP1 段核苷酸差异＞15%对CV-A10 毒株进行基因分型。

表1 全基因扩增及测序引物Tab.1 Primers of amplification and sequencing of complete genome

续表1 全基因扩增及测序引物Tab.1（Continued）Primers of amplification and sequencing of complete genome

2 结 果

2.1病毒在KMB17 细胞上的传代适应性 V6-19 ／XY ／ CHN ／ 2017 毒株在KMB17 细胞上适应性较好，第1 次适应性培养即出现CPE，见图1。提取病毒培养液RNA 进行RT-PCR 扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见756 bp 的目的条带，大小与预期相符，见图2。经测序、NCBI BLAST 比对为CV-A10，命名该KMB17 细胞适应株为K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017。将该毒株在KMB17 上连续传至15 代，V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株与适应后第5、10、15 代毒株的滴度分别为7.62、7.50、7.25 和7.75 lgCCID50／ mL。

图1 K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 毒株在KMB17 细胞上的适应性（× 100）Fig.1 Adaptation of K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 strain to KMB17 cells（× 100）

图2 K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株部分VP1 基因RT-PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoretic profile of RT-PCR product of partial VP1 gene of K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 strain

2.2病毒基因组序列分析 V6-19 ／ XY ／ CHN ／2017 株及KMB17 细胞适应株K6-19 ／ XY ／ CHN ／2017 第5、10、15 代分段扩增、测序和拼接后得到各代次毒株全基因组序列（不包含部分5'UTR 和3'UTR），长度分别为7 318、7 301、7 311 和7 310 nt。基因序列储存在GenBank 数据库，基因登录号为MT828546 ~ MT828549。CVA10 毒株的核酸编码区全长6 582 nt，编码1 个含2 193 个氨基酸的多聚蛋白。各代次毒株间全基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.99% ～100.00%和99.95% ～100.00%。见表2。

表2 K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株适应前后各代次全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性比较（%）Tab.2 Homologies of nucleotide and amino acid sequences of strain K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 of various passages before and after adaption（%）

2.3系统进化分析 对K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株适应前和适应后第5、10、15 代毒株以及GenBank中获得的61 株CV-A10 代表株的完整的VP1 序列（894 bp）进行系统进化分析，CV-A10 可分为7 个基因型（A、B、C、D、E 和F 型）。最早分离出的CV-A10原型株Kowalik 单独构成A 型；B 型由印度2013 年的分离株构成；C 型由法国、俄罗斯、西班牙和印度等国家流行的分离株构成；D 型由中国大陆和中国台湾地区2010 年前流行的分离株构成；E 型由非洲大陆的2 个CV-A10 分离株构成；F 型由越南、西班牙和中国26 个省份于2009 — 2017 年分离出的毒株构成。K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株与大部分中国大陆近年流行的分离株同属F 型。见图3。

图3 基于全长VP1 序列（894 bp）的CV-A10 系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of CV-A10 based on full-length VP1 nucleotide sequence（894 bp）

2.4病毒核苷酸与氨基酸序列变异分析 该毒株各代次核苷酸序列比对结果显示，适应前与适应后第5、10 代毒株全基因组（不包含部分5'UTR 和3'UTR）均无碱基突变，编码区均无氨基酸突变。仅适应后第15 代毒株在核苷酸序列VP4 区域的第172 位发生1 个碱基替换，由A 突变成G，导致1 个氨基酸由异亮氨酸（Ile）突变成缬氨酸（Val），氨基酸突变位点位于VP4 氨基酸序列第58 位。

3 讨 论

CV-A10 病毒颗粒的结构呈二十面体对称球形，直径约为30 nm。病毒衣壳由4 种结构蛋白（VP1 ~4）组成，VP1、VP2 和VP3 暴露在病毒表面，由69 个氨基酸组成的较小的VP4 则位于病毒内部［20］。有研究表明，VP4 N-末端豆蔻酰化信号位点（MGXXXS）是肠道病毒极为保守的特征［21］。在生理温度条件下，VP4 蛋白N-末端氨基酸残基能发生可逆性变构，暴露中和表位［22-23］。对EV-A71 嵌合病毒样颗粒的研究表明，VP4 中和表位由N-末端前20 个氨基酸构成［22，24］。本研究中，适应后第15 代毒株突变的氨基酸位于VP4 氨基酸序列第58 位（Ile→Val），未发生在可能影响EV-A71 中和表位的同源位置，也未发生在肠道病毒N-末端豆蔻酰化信号位点，但该氨基酸位点的替换是否会对毒株的免疫原性和衣壳稳定性造成影响有待进一步研究。

与VP1、VP2、VP3 基因相比，EV-A71 VP4 基因保守性更强［22］，但与本研究中对该CV-A10 毒株的各代次基因组分析结果不相符。在前期Vero 细胞适应株的遗传稳定性研究中，该毒株从RD 细胞适应至Vero 细胞后发生了4 个VP1 区域和1 个VP4区域的氨基酸突变，其VP4 区域突变的位置同样位于VP4 氨基酸序列第58 位，编码该氨基酸的碱基突变位点也同样位于VP4 核苷酸序列第172 位［19］。提示该位点极易突变，但其突变原因有待进一步研究。其他相关研究显示，VP1 较其他区域更频繁出现位点突变［25］。此外，K6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株在从Vero 细胞适应至KMB17 细胞后，病毒的核苷酸和氨基酸序列未发生变化，表明CV-A10 对Vero和KMB17 细胞的感染可能存在相似的机制。

V6-19 ／ XY ／ CHN ／ 2017 株可在KMB17 细胞中适应，连续传代培养后，4 个代次的病毒滴度维持在7.25 ～7.75 lgCCID50／ mL，差异在0.5 lgCCID50／ mL之内。虽然与该毒株在Vero 细胞中连续传代培养时的滴度（7.85 ～8.17 lgCCID50／ mL）［19］相比有所下降，但仍能满足《中国药典》三部（2020 版）规定的毒种检定中对病毒滴度的要求，即不低于6.5 lgCCID50／ mL。本实验中病毒较高的滴度水平也反应出KMB17 细胞有良好的病毒敏感性。

人源性细胞基质是一种无外源基因引入、无外源因子污染且细胞性状比较稳定的病毒性疫苗细胞基质，可使疫苗生产的纯化工艺较动物源性细胞基质更加简化，在节约生产成本的同时提高疫苗安全性，因此成为疫苗生产厂家的首选［16］。比较前期Vero 细胞适应株的遗传稳定性研究结果［19］，本研究中碱基的突变从8 个位点减少至1 个，氨基酸的替换从5 个位点减少至1 个，表明CV-A10 毒株在KMB17细胞中的遗传稳定性优于Vero 细胞。

综合安全性和毒株适应后遗传稳定性研究结果，KMB17 细胞具有良好的病毒敏感性，K6-19 ／XY ／ CHN ／ 2017 株在KMB17 细胞上连续传代后保持了较高的病毒滴度和遗传稳定性，KMB17 细胞可能比Vero 细胞更加适于作为CV-A10 疫苗的生产基质。为后续疫苗的研发奠定了实验基础。