长期不同施肥下褐土养分及酶活性的生态化学计量特征

2022-07-18陈浩宁周怀平文永莉

植物营养与肥料学报 2022年6期

陈浩宁，周怀平，文永莉，向云，程曼*

（1 山西大学黄土高原研究所，山西太原 030006；2 山西农业大学资源环境学院，山西晋中 030031）

生态化学计量学通过将生态计量和化学计量原理相结合，综合考虑自然选择、资源配置和消费者驱动营养物质循环理论等[1–2]，研究物质和能量在生态系统内生物和环境因子的相互作用下是如何保持平衡的。生态计量学常与生态系统的功能过程和生物行为相联系[3]，生物可以通过自身化学计量特征、群落结构、生态酶活性等方面的改变，以响应变化的底物计量特征[4]。生态酶研究主要集中在与有机质水解有关的 β-1, 4-葡萄糖苷酶 (β-1, 4-glucosidase, BG)、β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 (β-1, 4-N-acetylglucosidase, NAG)、亮氨酸氨基肽酶 (leucine aminopeptidase,LAP)、碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)等。土壤系统中水解酶活性及比值常与养分浓度或元素化学计量相联系，可作为反映微生物群落代谢活动对养分需求及养分有效性之间的生物地球化学平衡指标[5–6]。Allison等[7]深入研究调控土壤水解酶生产的环境因子，提出“进化经济原则”。Sinsabaugh等[8]提出生物地球化学平衡模型，探讨环境养分的有效性、酶活性和微生物生长效率之间的关系，指出在全球尺度上酶化学计量比BG∶(NAG+LAP)为1.41，BG∶ALP 为 0.62，(NAG+LAP) ∶ALP 为0.44[9]。Tian等[10]对土壤元素化学计量的研究表明，我国土壤C∶N、C∶P、N∶P平均为11.9、136和9.3。孙骞等[11]研究发现黄土高原旱作农耕区土壤C∶N、C∶P、N∶P平均为5.52、15.56和2.79。

内稳性是生态化学计量学存在的前提[12]，即当土壤中可利用资源的计量比发生变化时，微生物可以通过改变生态酶计量比从有机质中获取资源来维持自身生物量比的稳定[13]。“资源分配理论”指出，微生物会将更多的能量和养分分配于获取限制性资源酶的生产[14]，因此，土壤酶活性及酶计量比可作为反映微生物代谢受能量和养分限制程度的敏感指标。在农田系统中，对土壤养分和生态酶活性关系的研究主要是通过长期肥料单施或混施调节底物有效性实现。由于不同施肥处理养分投入比和种类的差异，使C、N和P在生态系统内部生物和环境之间循环的不确定性增加，会影响微生物群落结构和酶活性表达，从而改变农田生态系统的结构与功能[15–16]。目前关于长期施肥对农田生态系统影响的研究主要集中于土壤肥力、微生物群落组成和土壤酶活性等方面，也有一些关于农田的元素计量范围的研究[17–19]。而将元素计量与酶计量结合，可从微生物资源限制角度探讨褐土农田元素循环的生物地球化学特征。依托山西寿阳旱地农田生态系统野外科学观测研究站，借助生态化学计量学手段，研究褐土元素和酶活性生态化学计量对长期不同施肥处理的响应特征，探讨长期不同施肥土壤养分的限制性及酶活性表达的反馈机制，为进一步调控褐土碳、氮、磷元素平衡，改善农田土壤肥力和实现可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验站位于山西省寿阳县宗艾镇(37°58′N，113°06′E)，海拔 1130 m，土壤类型为褐土，成土母质为马兰黄土，土层深厚。年平均气温7.4℃，无霜期约130天，年平均降雨量501 mm，年际间变化较大，干燥指数1.3，属于半湿润偏旱区。长期定位试验布设前(1992年)耕层土壤(0—20 cm)基本化学性质为有机碳13.81 g/kg、全氮1.05 g/kg、全磷0.76 g/kg、全钾 14.10 g/kg、有效氮 118 mg/kg、有效磷4.84 mg/kg、pH 8.4。

1.2 试验设计

长期定位施肥试验开始于1992年，试验布设参考徐明岗等编著的《中国农田土壤肥力长期试验网络》[20]。采用氮、磷、有机肥三因素四水平正交法设计施肥小区，共18个处理，随机排列，无重复，各小区面积为66.7 m2。试验用氮肥为尿素(N 46%)，磷肥为过磷酸钙(P2O514%)，有机肥为新鲜牛粪(有机质 90.5～127.3 g/kg、全氮 3.39～4.97 g/kg、全磷1.37～1.46 g/kg、全钾 14.1～34.3 g/kg)，每年秋季玉米收获后结合耕翻一次性施入。本研究选取其中9个处理，即无施肥对照处理(CK)；4个氮磷化肥处理 N1P1、N2P2、N3P3和 N4P4；4个有机肥处理N2P1M1、N3P2M3、N4P2M2和 M6。各处理施肥量见表1。

表1 1992—2016年各处理年均施肥量(kg/hm2)Table 1 Annual fertilizer input in each treatment from 1992 to 2016

1.3 样品采集与测定

分别于1992年播种前和各施肥处理2001、2006、2016年秋季玉米收获后采集0—20 cm土层土壤样品，各施肥小区按“S” 形5点采样混合形成一个土样，去除土样中可见植物残体及石块，将土样分成两份，一份在自然条件下风干后过2 mm筛测定土壤化学性质，另一份过1 mm筛后保存在4℃冰箱内用于测定土壤酶活性。

土壤基础化学性质测定参考《土壤农化分析》[21]。采用微孔板荧光法[22]测定土壤BG、NAG和ALP活性，底物分别为4-MUB-β-glucopyranoside、4-MUBN-acetyl-β-D-glucosaminide 和 4-MUB-phosphate，MUB可以在365 nm波长激发，在450 nm处检测到荧光[23]，通过土壤酶水解反应将其释放，检测荧光量来表征土壤酶活性。酶活性计算参考DeForest[23]的方法，单位为nmol/(g·h)，并将酶活性值通过log对数变换以满足正态分布。

1.4 数据分析

所有试验数据用 Microsoft Excel 2019 整理，Origin 2018作图。不同施肥处理土壤生态酶活性及化学计量比之间显著性差异通过SPSS 19.0单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD实现，土壤元素、酶活性及化学计量比之间的相关性采用Pearson相关分析研究，通过逐步回归进一步分析土壤元素与酶活性之间的关系。

本研究中土壤有机碳、全氮和全磷之间的比值分别以C∶TN、C∶TP、TN∶TP表示，考虑到施肥对农田土壤养分资源的影响，故计算有机碳与有效养分之间的计量比C∶AN、C∶AP、AN∶AP。由于有机碳与有效养分之间的比值差异过大，故对其进行对数变换，将AN∶AP值扩大10倍以避免变换产生负值。土壤酶计量比通过lnBG/lnNAG、lnBG/lnALP和lnNAG/lnALP计算得出。向量角度 (vector angle)>45°越大表示微生物受磷限制越强，向量长度(vector length)越长表示微生物受碳限制越严重。向量角度 (vector angle) 和向量长度 (vector length) 通过公式 (1)和公式 (2)计算[24]：

2 结果与分析

2.1 长期不同施肥下土壤养分化学计量比变化特征

表2显示，与试验初期(1992年，数据见1.1部分)相比，高量有机肥处理(M6)土壤有机碳含量的年增长速率最快，为0.36 g/(kg·a)，说明高量有机肥投入可以促进土壤有机碳固存。2001—2016 年，与CK、单施化肥处理相比，化肥配施有机肥处理土壤全氮和有效氮含量无明显变化，高量有机肥处理土壤全氮和有效氮含量明显提高，这表明旱作玉米中氮磷化肥处理基本可以维持土壤氮库稳定，有机肥的投入则可促进土壤氮库和有效氮累积。整体上，土壤全磷含量随化肥和有机肥投入量增加而增加。与试验初期相比，连续施肥24年后高量有机肥处理土壤有效磷年增长速率为8.78 mg/(kg·a)，显著高于CK和化肥处理，这表明长期施肥处理有利于提高土壤全磷和有效磷含量，有机肥处理的提高效果更优(表2)。

表2 长期不同施肥下土壤有机碳及全量和有效态氮、磷含量Table 2 The contents of organic C, and total and available N and P in soils under different long-term fertilization treatments

图1A显示，土壤C : TN在各化肥和CK处理之间不存在显著差异，有机肥处理以N2P1M1、N3P2M3和M6处理土壤C: TN较CK处理显著降低了23.1%～30.2% (P<0.05)。图1B和C显示，土壤C∶TP和TN∶TP比均随化肥投入量增加而降低。其中，在N4P4处理土壤C∶TP较CK处理显著降低了23.3%(P<0.05)，TN∶TP降低了17.6% (P>0.05)；同时4个化肥处理和4个有机肥处理之间土壤C∶TP均不存在显著差异，而土壤TN∶TP在M6处理显著高于其他各处理 (P<0.05)。图1D显示，土壤C∶AN的变化范围为2.11～2.29 (均值)，各处理之间彼此不存在显著差异。图1E和F显示，土壤C∶AP和AN∶AP随化肥和有机肥投入量增加而降低，且4个有机肥处理土壤C∶AP和AN∶AP较4个化肥处理降低的幅度更大。综上表明，长期定位施肥试验显著改变了褐土农田土壤元素库结构，其中化肥处理土壤全磷相对提升更显著，而有机肥在对土壤有效养分的改善作用上明显优于单施化肥，并随投入量增加土壤C∶AP和AN∶AP显著降低。

图1 长期不同施肥处理土壤元素计量比变化特征Fig.1 Characteristics of stoichiometric ratios of soil elements under different long-term fertilization treatments

2.2 长期不同施肥下土壤酶活性及化学计量比变化特征

2.2.1 土壤酶活性特征图2中，长期不同施肥处理土壤 BG 活性为 2.47～4.28 nmol/(g·h)。CK 和单施化肥4个处理BG活性随施肥年限增加而降低。经过24年褐土长期施肥后，M6处理BG活性为4.17 nmol/(g·h)，显著高于其他处理。土壤NAG和ALP活性分别为 0.65～2.95 和 1.27～3.10 nmol/(g·h)，除N1P1处理外，CK和其他化肥处理NAG和ALP活性在年限的变化上均以2016年最低。24年长期试验后，M6处理土壤NAG活性显著高于其他各施肥处理，ALP活性以N1P1和M6处理显著高于CK处理。双因素方差分析发现，施肥年限、肥料化学性质与投入配比、年限与肥料之间的交互作用是影响褐土土壤酶活性的关键因子。综上说明长期施用大量氮磷化肥会抑制土壤酶活性，有机肥施用可以起到改善作用。

图2 长期不同施肥下土壤酶活性变化特征Fig.2 Changes of soil eco-enzymatic activities under different long-term fertilization treatments

2.2.2 土壤酶活性化学计量比特征图3中，N2P2、N3P3和N4P4化肥处理土壤酶计量比lnBG/lnANG略高于有机肥处理，lnNAG/lnALP略低于有机肥处理，但各处理彼此间不存在显著差异(P>0.05)。通过与1992年 (试验开始年) 酶计量值比较，发现施肥试验后本研究区土壤lnBG/lnNAG较1992年整体升高了37.3%～116.7%，lnNAG/lnALP降低了32.0%～53.1%。

由长期不同施肥处理土壤酶化学计量向量角度和向量长度(图4)可知，相比于1992年，各施肥处理下向量角度均＞45°，向量长度增加了11.1%～52.4%，长期定位试验加剧了褐土中微生物代谢的磷和碳限制。长期定位试验向量角度和向量长度在各处理彼此间不存在显著差异 (P>0.05)。其中，化肥施用以N1P1(低量) 处理下向量角度和长度最低，有机肥施用以 M6处理最低，而 N2P2、N3P3和 N4P4处理向量角度和长度均高于各有机肥处理。以上说明，相比大量单施化肥，低量施用下土壤微生物代谢的磷和碳限制程度较弱，同时有机肥处理特别是高量有机肥可以有效缓解微生物的磷和碳限制。

2.3 土壤元素及其计量比与酶活性及其计量比之间的相关性分析

由表3可知，有机碳(C)、全磷 (TP) 及有效磷(AP) 与酶活性及化学计量比之间均不存在显著相关关系，全氮(TN) 与BG、NAG和lnNAG/lnALP之间存在显著正相关关系，有效氮(AN)与BG、NAG和ALP酶、lnBG/lnNAG和lnNAG/lnALP呈显著或极显著的相关关系。从生态化学计量角度看，C∶TN和C∶AN与lnBG/lnNAG之间存在极显著正相关，C∶TP和C∶AP与lnBG/lnALP之间相关关系未达到显著水平，TN∶TP与lnNAG/lnALP之间存在显著正相关，AN∶AP与lnNAG/lnALP之间不存在显著相关关系。

表3 土壤养分含量及其计量比与酶活性及其计量比之间的相关系数(r)Table 3 The correlation coefficient between soil nutrient contents and their stoichiometric ratios and enzyme activities and their stoichiometric ratios (r)

进一步逐步回归发现，AN分别解释了BG 36.6%、NAG 42.7%、ALP 14.9% 和 lnNAG/lnALP 41.9% 的变异，AN和TP共同解释了lnBG/lnNAG 43.4%的变异了(表4)，说明有效氮在调节褐土农田土壤酶活性及化学计量比上发挥着关键作用。

表4 酶活性及计量比与土壤养分的逐步回归分析Table 4 Stepwise regression of soil enzyme activities and their stoichiometric ratios and soil nutrients

3 讨论

3.1 土壤元素化学计量特征对长期不同施肥的响应

土壤C∶TN作为预测有机质分解作用和碳氮饱和诊断指标，影响着碳氮循环过程[25]，土壤C∶TN的高低与有机质的分解速率成反比[2]。长期24年施肥试验土壤C∶TN为12.86 (均值)，高于中国土壤平均值 (11.9)[10]，符合耕层土壤有机质碳氮比变化范围(8∶1～15∶1)[2]，褐土有机质矿化速率表现出相对缓慢的特点[26]。有机肥投入下土壤C∶TN (11.29，均值)显著低于CK处理 (14.54，均值)，说明有机肥施用可以加速土壤有机质分解。这是因为有机肥施用后有效缓解了微生物碳限制 (图4B)，促进了微生物生长繁殖，显著提高的生物量 (较CK处理提高50%～76%[27–28])刺激其对有机质矿化的强度和土壤可溶性有机碳的消耗。

一般认为，土壤C∶TP可以反映微生物矿化有机质过程中磷素的释放与固持之间的平衡[26]，较低的碳磷比意味着微生物分解有机质释放有效磷的潜力较大，本区域土壤C∶TP为16.28 (均值)，显著低于中国土壤的136[10]。杨振兴等[29]研究发现，长期施用化肥主要增加了HCl-P和Residual-P两种形态磷，而在褐土中这两者都是极易被固定的类型。本区域土壤C∶TP随化肥投入量增加而降低，高量化肥处理(N4P4) 显著低于CK处理，说明长期单施化肥会降低土壤磷素利用率，易形成难溶的稳定态磷而大量固存于土壤，这与王传杰等[17]的研究结果相似，图4A中不断增加的磷限制也证明了此观点。

土壤TN∶TP常用来确定土壤养分的限制因子和限制阈值[2, 26]。本研究中土壤 TN∶TP 为 1.31 (均值)，显著低于中国土壤9.3[10]，说明本区域磷素含量相对丰富。土壤TN∶TP随化肥投入量增加而降低，N4P4(1.02) 显著低于 N1P1(1.28) 和 N2P2(1.20) 处理，这是由于化肥处理褐土磷素容易以难溶的稳定态固定于土壤中，并随化肥投入量增加磷库固定越大[29]，而TN则基本保持稳定(表2)，造成土壤TN∶TP显著降低，也表明化肥处理对土壤磷库影响作用更大。高量有机肥处理 (M6) 土壤 TN∶TP (均值1.74) 显著高于 CK (1.23) 和各化肥处理 (1.15)，可能是有机肥的投入促进了磷库活化并为土壤带来大量有机氮[30]，造成土壤TN∶TP相对升高。本研究施肥处理TN∶TP变化趋势与前人研究结果[18–19]基本一致。对比不同施肥处理土壤C∶AP与AN∶AP之间的差异，发现土壤有效磷较有机碳和有效氮增幅更大，且有机肥在提高土壤养分有效性特别是有效磷含量上的效果更优于化肥处理。

综上可知，长期不同定位施肥试验显著改变了褐土元素化学计量关系。单施化肥主要促进了磷素固持，造成土壤C∶TP和TN∶TP显著降低；有机肥则可促进褐土有机质分解，改善养分供应的连续性，显著提高土壤有效磷含量。

3.2 土壤酶活性化学计量特征对长期不同施肥的响应

本研究中酶化学计量C∶N∶P大致为5∶2∶3，区别于全球尺度1∶1∶1[9]，反映出长期施肥条件下褐土可利用的碳磷元素相对缺乏，整体较高的BG和ALP活性也说明微生物可以通过调控酶的表达来适应资源稀缺的土壤环境。

不同施肥处理下土壤酶计量比、向量角度和长度特征，可以反映微生物生长和代谢过程中能量和资源限制差异[13,24]。“资源分配理论”指出，土壤中资源的有效性与土壤酶的相对活性之间存在耦合关系，当环境底物充沛而有效资源稀缺时，微生物会将更多的能量 (C)和养分 (N、P)分配于获取限制性资源酶的生产[14,31]。本研究中 N2P2、N3P3和 N4P4处理下，土壤 lnBG/lnNAG、酶向量角度和长度略高于各有机肥处理(P>0.05)，而 lnNAG/lnALP 略低于各有机肥处理 (P>0.05)，这是因为化肥处理作物产量显著增加的同时大量消耗土壤中可溶性有机碳和有效磷[17]，且无机磷施入褐土后容易与钙、镁等元素结合而降低磷素的可利用性，加剧微生物代谢活动中碳和磷限制 (图4A)，微生物在与植物竞争能量和资源的过程中会将更多的目标放在BG和ALP生产上，造成lnBG/lnNAG更高，lnNAG/lnALP更低。而有机肥的投入刺激了土壤有机质分解并大幅提高了AP含量 (图1)，可以满足微生物生长对能量和资源的需求，有效缓解碳和磷限制，造成BG和ALP活性相对降低，这与崔继文等[32]研究结果基本一致。蓝贤瑾等[33]在红壤的研究结果表明，长期有机肥处理显著提高了微生物对氮素需求，从而刺激分泌更多NAG改变了酶化学计量比，与本研究NAG活性和向量角度的变化具有相似性。

图4 长期施肥处理下土壤酶化学计量向量角度和向量长度变化Fig.4 Vector angle and vector length of soil enzymatic stoichiometry under different long-term fertilization treatments

另一方面，本研究酶化学计量的变化可能与长期施肥引起微生物学特征改变有关。前人研究发现，BG和ALP活性相对升高与微生物群落中真菌相对富集存在显著相关性[5,34]。真菌更高的生物量C∶N意味着对C需求更大[35]，本研究中长期化肥处理土壤相对更高的有机碳含量或许为真菌富集提供了机会，有利于BG活性相对提高，而有机肥施用则使土壤向高质方向发展 (图1)，为好营养的细菌富集创造条件。最近，Chen等[36]研究指出，酶催化的土壤有机质分解更有可能是由编码水解酶的微生物功能基因驱动的，功能基因相对丰度改变的影响反映在相应的酶活性上。Luo等[37]针对C∶N∶P计量平衡与土壤生态功能稳定性的关系研究发现，土壤元素含量与编码水解酶的功能基因之间存在显著相关性。据此我们推断，本研究中土壤酶化学计量lnBG/lnNAG和lnNAG/lnALP在长期化肥和有机肥处理之间的差异，可能与肥料性质对土壤C∶N∶P和生态功能的作用程度不同有关，造成编码水解酶的微生物功能基因丰度调整，从而引起酶活性相对改变。

综上，土壤酶计量比和向量特征揭示，褐土施肥处理后微生物代谢整体面临强烈的磷限制，且化肥处理易加剧微生物碳和磷限制，有机肥可缓解土壤微生物资源限制程度。本区域酶活性化学计量变化符合Allison等[7]提出的酶生产“进化经济原则”。

3.3 土壤元素和酶活性化学计量关系研究

相关性分析和逐步回归结果表明，有效氮对BG、NAG、ALP活性和酶化学计量lnBG/lnNAG与lnNAG/lnALP有很好的解释作用。前人研究发现，以蛋白质为主体的水解酶合成需要足够的氮素供应[38]；处于资源胁迫中的微生物会减少对获取环境中非稀缺资源酶的投资[31]。除高量有机肥处理外，其他施肥处理土壤有效氮含量较1992年有不同程度的降低 (参见1.1部分)，但基本可以满足微生物生存需求，相应的会减少NAG合成[31]；本区域微生物代谢整体受到碳、磷限制的影响，会将更多的氮素用于生产并维持相对更高的BG和ALP活性 (图3)，造成有效氮与lnBG/lnNAG和lnNAG/lnALP之间存在极显著相关性 (P<0.01)。以上结果表明土壤酶活性表达存在资源依赖性，有效氮在调节褐土酶活性和酶化学计量的变化上发挥着关键作用。

另外发现，本研究中所涉及的因子均不能很好地解释酶计量lnBG/lnALP变异，AN∶AP与lnNAG/lnALP之间也不存在相关关系，说明本研究通过水解酶和元素计量之间的关系，来研究农田土壤微生物资源需求与元素生物地球化学循环存在一定不足。一方面，可能是环境中各种生物或非生物因子(土壤团聚体、温度、微生物群落组成等[31])具有更强烈的间接干扰作用，影响了酶活性比与土壤元素组成间的相关性[5]，而这些因子在本研究中并未测定。另一方面，本研究的特殊性在于农田持续的外源底物供应，往往比土壤原有底物更容易被生物利用，从而扰乱了土壤中酶系统对原有底物的响应特征。