不同来源有机肥释放的溶解有机质粒径分布与光谱特征

李财生，吴月颖，陈丽铭，吴治澎*，侯正伟，黄 成，吉恒宽，符传良，吴蔚东

（1 海南大学热带作物学院，海南海口 570228；2 海南省农业科学院农业环境与土壤研究所 / 农业农村部海南耕地保育科学观测实验站 / 海南省耕地保育重点实验室，海南海口 571100）

有机肥在农业生产过程中具有肥效周期长、促进微生物活动、改良土壤结构等优点，有机肥与化肥配施不仅能够弥补单独使用化肥造成的微量元素不足的问题，还可以促进作物生长，减少化肥的用量与损失[1–2]。溶解有机质 (dissolved organic matter,DOM)通常被定义为能通过 0.7 μm、0.45 μm 或 0.2 μm等微米滤膜的一类有机化合物[3–5]，其具有较高的反应活性、移动性，在调节土壤呼吸、植物生长、微生物代谢及养分循环中起着重要作用[6–7]。有机肥在施入土壤后，会带入土壤大量的DOM，DOM较高的反应活性会影响土壤的性质。由于不同有机肥释放的DOM不同，进而影响土壤DOM的性质及其环境行为[8–9]。因此，有必要研究不同有机肥释放的DOM的组成性质。

DOM是一种多分散、高度复杂和非均相的混合物，其结构复杂，因此很难在分子水平上完全表征其组成[10]。然而，DOM含有大量的光吸收和发光基团，使光谱学成为跟踪其固有性质的有效工具[11–12]。国内外的研究者已经使用各种光谱法研究DOM，例如傅里叶变换红外光谱 (FTIR)、紫外‒可见吸收光谱(UV-Vis)、三维荧光光谱 (3D-EEM)、核磁共振波谱仪 (NMR)和高效液相色谱质谱 (HPLC-MS)等[13–14]。杨银等[15]研究发现，由于不同的空间位置及周围环境，会影响不同水源地DOM的荧光组分。李婉秋等[16]研究表明，不同秸秆生物炭的DOM因原料不同其含量和性质存在差异，与Cu2+的络合能力和亲和力也不同。DOM的来源影响DOM的含量以及组成，进而影响DOM的各种性质。大量研究表明，不同有机肥的DOM的光谱特征差异明显[17–19]。不同粒径的DOM光谱性质有着明显的差异，Tareq等[20]研究发现，地下水和地表水DOM中具有相对较高的小分子百分比，高分子量的NOM的荧光强度可能低于低分子量的DOM，小分子具有更强的荧光活性。很多研究都集中在水环境的DOM[21–23]，但针对有机肥不同粒径的DOM的含量组成以及光谱特征的研究较少。

因此，本研究采用超滤分级技术，综合使用FTIR、UV-Vis和3D-EEM结合平行因子分析，研究4种不同来源有机肥释放的溶解有机质的粒径分布和光谱特征，为有机肥在农业生产中的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 有机肥样品的采集

在前期研究[24]的基础上，选择符合国家标准(NY 525―2012) 的4种具有代表性商品有机肥，包括海藻有机肥 (青岛明月蓝海生物科技有限公司)、羊粪有机肥 (海口南渝农资有限公司)、虾肽有机肥(湛江博泰生物有限公司)和小麦秸秆生物炭肥 (南京智融联科技有限公司，制备温度500℃)。

1.2 有机肥DOM溶液的提取和分级

有机肥DOM溶液的提取主要依据Huang等[25]的方法，所有样品均风干，研磨通过1 mm筛，然后用于提取DOM，简言之，称取20 g有机肥，用超纯水以 1/10 的固/液比 (干重) 提取，所有样品在 220 r/min和25℃下振荡24 h，并使用离心机在4000 r/min下离心30 min，上清液储存在4℃下直到使用。

使用上清液提取有机肥中的DOM (粒径<0.7 μm)，并用超滤装置进行分级，具体地说，DOM溶液依次通过装有孔径大小为0.7 μm、0.2 μm、100 kDa、1 kDa的滤膜的密闭超滤杯，通入氮气加压，用棕色瓶盛装滤好的DOM溶液，分别为粒径 <1 kDa、1～100 kDa、100 kDa～0.2 μm、0.2～0.7 μm下的滤液，不同孔径下的滤液即代表不同分子量的DOM溶液，将滤液保存于4℃冰箱，用于后续的实验。采用岛津TOC-L型总有机碳 (TOC) 分析仪测定各粒径总碳及无机碳含量，两者的差值为溶解性有机碳 (DOC)。

1.3 光谱测定

将4种不同粒径下的 DOM 溶液分别进行FTIR、UV-Vis、3D-EEM的测定，并计算SUVA254[26]、SUVA260[27]、腐殖化指数 (humification index, HIX)[28]、荧光指数 (fluorescence index, FI)[29]和自生源指数(autochthonous index, BIX)[30]，具体方法以及指标含义如下：

红外光谱：将DOM溶液冷冻干燥，压片，采用傅里叶变换红外光谱仪 (Spectrum 65，珀金埃尔默公司，美国) 扫描，扫描波数范围 4000～450 cm–1，使用Origin 9.0 对各特征峰积分，计算各对应官能团的相对含量[31]。

紫外可见光谱：采用紫外可见分光光度计 Lambda 25 UV spectrometer (PerKinEImer) 测定，设定扫描范围：起始波长 800 nm，终止波长 220 nm，时间间隔1 nm。

三维荧光光谱：采用 F-320 荧光光谱分析仪 (天津港东科技)，150 W 氙灯为激发光源，光电倍增电压为 700 V，扫描波长范围为激发波长 Ex=200～450 nm，发射波长Em=230～650 nm，激发波长和发射波长增量均设为5 nm，狭缝宽度为10 nm，扫描间隔为 1 nm，扫描速度为 2400 nm/min。

SUVA254：254 nm处UV的吸光系数与DOC浓度之比 (SUVA254= UVA254/DOC)，示踪 DOM 的芳香性，其值越大，表明芳香化程度越高，有机物越难被分解和利用。

SUVA260：260 nm处UV的吸光系数与DOC的浓度之比，表示DOM中疏水性组分的含量，值越大，DOM疏水组分所占比例越高。

腐殖化指数 (humification index, HIX)：254 nm激发波长下，荧光发射光谱中435～480 nm区域与300～345 nm区域的峰面积比值。值越高，表明腐殖化程度越高，DOM 较稳定。HIX<4，表明DOM腐殖化程度较低；HIX>10，则腐殖化特征强。

荧光指数 (fluorescence index, FI)：荧光激发波长 370 nm 时，450 nm 与 500 nm 处发射光谱强度的比值，用来区分DOM的主要来源。FI>1.9，主要为微生物活动所产生的内源DOM，自生源特征明显；FI<1.4，主要为以陆源输入的外源性 DOM，自身生产力和微生物活动等贡献相对较低。

自生源指数 (autochthonous index, BIX)：310 nm激发波长下，发射波长380 nm与430 nm处荧光强度的比值，反映DOM自生源相对贡献，BIX值越大，自生源特征越明显，类蛋白组分贡献越大，生物可利用性越高。BIX在0.6～0.7，DOM自生组分较少，代表陆源输入或受人类影响较大；BIX>1时，类蛋白组分贡献大，代表生物或细菌引起的自生来源且有机质为新近产生，生物可利用性高。

1.4 数据分析

采用Excel 2016和SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。所有试验测定3个重复，试验数据均为3个平行样品测定的数据的平均值±标准差。使用单因素方差分析作显著性检验，邓肯 (Duncan) 测验用于多重比较 (α= 0.05)，并运用 Origin 9.0 作图。

采用Matlab 2016b软件对EEM光谱数据进行平行因子分析，将原始EEM光谱数据进行转化矫正并扣除空白，数据归一化处理后提取模型得到2～7个组分，经裂半分析、核心一致性分析和随机初始化方法，最终确定出各有机肥的荧光组分为3～4个。

2 结果与分析

2.1 不同来源有机肥溶出DOC的含量及粒径分布

从总量上看，4种有机肥DOC的含量以羊粪最高，达到2989 mg/kg，其次为海藻和虾肽，分别为1266和1060 mg/kg，而小麦秸秆生物炭的含量最低，仅为308 mg/kg (图1)。4种有机肥各粒径间释放的DOC含量差异明显。从各粒径含量来看，4种有机肥提取的DOC含量随着粒径的减小呈波动变化趋势，在粒径<1 kDa时DOC含量达到最高。4种有机肥各粒径DOC含量各不相同，但都以最小粒径(<1 kDa) 所占比例最高，除海藻为47%外其余有机肥处理皆达到50%及以上，其大小顺序为：海藻(47%)<虾肽 (53%)<小麦秸秆生物炭 (57%)<羊粪(70%)。

图1 有机肥中各粒径溶解性有机碳的含量及其百分比Fig.1 Concentration and percentage of dissolved organic carbon (DOC) with different size fractions in organic fertilizers

2.2 不同来源有机肥各粒径DOM的紫外‒可见光谱和荧光光谱特征值

为了解不同来源有机肥各粒径DOM的光谱特征，本研究对DOM的紫外‒可见光谱 (SUVA254和SUVA260) 和荧光光谱特征值 (BIX、FI和 HIX) 进行分析 (表1)。随着粒径的减小，不同有机肥DOM的SUVA254和SUVA260值逐渐减小，其芳香化程度和疏水性组分含量逐渐降低。小麦秸秆生物炭的DOM在0.2～0.7 μm粒径下的SUVA254和SUVA260要高于其他3种有机肥，其他3个粒径的SUVA254和SUVA260均低于其他有机肥，表明其芳香组分和疏水组分主要为大粒径分子。从各个粒径上看，不同有机肥DOM的BIX值和FI值随着粒径的减小逐渐增大，其自生源成分逐渐减小，蛋白成分逐渐增多，受微生物的影响逐渐减小，以陆源输入为主的外源性DOM的组分增加。虾肽DOM各个粒径的BIX>1，这表明其类蛋白组分含量高，自生来源有机质丰富，生物可利用性高；羊粪DOM各粒径的BIX介于0.6～0.7，表明其受人类影响较大。虾肽DOM各个粒径的FI>1.9，表明其主要为内源DOM；而小麦秸秆生物炭的 DOM的 0.2～0.7 μm 和 100 kDa～0.2 μm粒径组分的FI<1.4，这表明其DOM的较大粒径组分主要为外源性，自身生产和微生物活动贡献相对较低。不同有机肥DOM的HIX值随着粒径的减小而减小，随着粒径的减小DOM的腐殖化程度逐渐降低，此外，尽管HIX的值逐渐减小，海藻、羊粪和虾肽(虾肽DOM的<1 kDa组分除外，其HIX为7.17)多数粒径的DOM腐殖化程度依旧较高(HIX>10)，而小麦秸秆生物炭 1～100 kDa 和<1 kDa粒径组分的腐殖化程度低 (HIX<4)。

表1 不同来源有机肥各粒径DOM的紫外–可见光谱和荧光光谱特征值Table 1 Characteristic values of UV-Vis and fluorescence spectra of DOM with different size fractions of different organic fertilizers

2.3 不同来源有机肥各粒径DOM三维荧光组分

利用Matlab平行因子分析，表2列出了海藻、羊粪和虾肽有机肥DOM识别出的4个组分，分别为C1、C2、C3和C4；小麦秸秆生物炭肥DOM则识别出C1、C2和C3这3个组分 (表3)。

表2 3种有机肥(海藻、羊粪和虾肽)的荧光组分特征Table 2 Characteristics of fluorescent components in three organic fertilizers (seaweed, sheep manure and shrimp peptides)

表3 小麦秸秆生物炭的荧光组分特征Table 3 Characteristics of fluorescent components in wheat straw biochar

由不同来源有机肥各粒径DOM三维荧光组分分布(图2)可知，4种有机肥的DOM各粒径的组分差异明显，除小麦秸秆生物碳的DOM在1～100 kDa C2组分占比最低外，4种有机肥的DOM皆以C2组分的含量最高，除羊粪和秸秆生物炭以外，4种有机肥的DOM以C4组分含量最低，这表明这4种有机肥的DOM主要以类腐殖质荧光物质为主，而色氨酸等类蛋白成分较少。从各粒径上来看，随着粒径的减小，C1和C2组分的含量呈波动变化，多在<100 kDa时含量最低，而在 <1 kDa时含量最大(羊粪和小麦秸秆有机肥除外)。

图2 不同来源有机肥各粒径DOM组分分布Fig.2 DOM component distribution of different organic fertilizers with different size fractions

2.4 不同来源有机肥各粒径DOM的红外光谱特征

图3显示了4种不同来源有机肥在粒径 <0.7 μm和粒径 <1 kDa下DOM的红外吸收光谱。不同有机肥来源的DOM在两种粒径下的红外吸收曲线特征峰类似。694 cm–1附近出现的信号峰表明烯烃CH2―存在，1100 cm–1附近出现的信号峰表明醇、多糖中C—O伸缩振动的存在[39]，1400 cm–1附近出现的信号峰表明脂肪烃和含―CH3化合物C―H对称弯曲振动的存在[40]，1635 cm–1附近出现的信号峰表明芳香烃中C=C键的振动、烯烃中 C=C 键、羧酸盐中―COO–以及酰胺中C=O官能团的不对称伸缩以及氨基酸氨基N―H的伸缩振动的吸收[41]，3400 cm–1附近出现的信号峰表明氨基酸盐中的N―H、醇、酚以及羧酸中羟基O―H存在[26]。

图3 不同来源有机肥两种粒径DOM的红外光谱Fig.3 FTIR spectrum of DOM with two size fractions of different organic fertilizers

从4种不同来源有机肥在粒径 <0.7 μm和粒径<1 kDa下 DOM 的红外吸收光谱各官能团的相对含量 (表4)可以看出，在全量 (<0.7 μm) 上，4 种有机肥各个官能团相对含量不同，当粒径 <1 kDa时，各个官能团相对含量显著降低。在粒径为 <0.7 μm时，4种有机肥以氨基酸盐中的N―H或羟基O―H含量最高，以烯烃CH2―含量最少，其次是C―O 键(除羊粪外，羊粪含有丰富的甲基―CH3、C―H键)，这表明4种有机肥的DOM均含有较多的醇、酚、多糖和碳水化合物。在粒径 <1 kDa时，虽然各官能团的相对含量显著降低，但其含量大小顺序不变，仍以氨基酸N―H键和羟基O―H含量最高，其次是芳香烃的C=C双键和甲基―CH3、C―H键，而虾肽和小麦秸秆生物炭的DOM还含有较多C―O键。

表4 不同来源有机肥两种粒径DOM各官能团的相对含量(cmol/kg)Table 4 Relative contents of functional groups of DOM with two size fractions in different organic fertilizers

3 讨论

3.1 不同来源有机肥DOC粒径分布和含量差异

由DOC各粒径的含量分布及百分比 (图1)看，4种有机肥DOC各粒径含量存在明显差异，且DOC主要分布在小粒径 (<1 kDa)。从全量 (粒径<0.7 μm)上看，小麦秸秆生物炭的DOC含量最低，这是因为生物炭中易分解的纤维素、半纤维组分的含量相对较低，溶解性有机物释放减少[42]。田腾等[43]研究发现，从水稻秸秆、猪粪、鸡粪和牛粪中提取的DOC的含量顺序为猪粪>鸡粪>牛粪>水稻秸秆。不同有机物料其蛋白质、糖分、纤维素等组分比例不同，因而DOC含量会存在差异，其DOC的各粒径分布也会存在差异。张丰松等[18]研究发现，不同种类的动物粪便及其堆肥不同分子量的DOC含量存在明显差异，且猪粪的DOC小分子量部分占比高。Guo等[44]在研究密西西比河的DOC时发现，高分子量部分 (粒径 0.2 μm～1 kDa) 占比均在 40% 左右；Xu等[22]在研究水环境中的DOM时发现，低分子量(粒径<1 kDa) 的 DOM 含量 (41.2 %)小于高分子量(粒径 0.45 μm～1 kDa) 的含量 (58.8 %)，这与本研究的结果相反。不同的分级方式会影响DOC的粒径分布，由于DOC是非均质混合物，使用不同系列孔径的滤膜提取DOC，其粒径分布可能会不同，因此，DOC的粒径分布不仅与源相关，也可能与使用的特定膜的孔径有关[21]。

3.2 不同来源有机肥各粒径DOM的光谱特征

本研究中，4种有机肥各粒径的DOM紫外光谱特征值中，虾肽、海藻和羊粪差异并不明显，但小麦秸秆生物炭的大粒径 (0.2～0.7 μm) 和小粒径间差异显著，且各有机肥的SUVA254和SUVA260随着粒径的减小而减小。小麦秸秆生物炭DOM在粒径0.2～0.7 μm 的 SUVA254和 SUVA260最大，其芳香化程度最高，分子量大且疏水性成分含量高，即小麦秸秆生物炭DOM含有较多的大分子量的腐殖质物质(如酚类物质等)，研究表明，生物质中的不稳定有机化合物 (如半纤维素和纤维素) 比稳定的化合物更有可能在低于500℃的温度下降解，导致生物炭中DOM向更稳定的芳香结构富集[45]。4种有机肥各粒径的SUVA254和SUVA260具有同样的变化趋势，研究表明，SUVA254和SUVA260存在正相关关系，芳香结构和疏水性存在密切关系，即芳香性结构主要存在于疏水组分中[46]，吴月颖等[13]在研究不同水稻土各粒径DOM时也有类似发现。

4种有机肥各粒径的HIX差异显著，且随着粒径的减小而减小，有机肥的腐熟过程中，其腐殖化程度不断增加，多肽和糖类等转化为大分子的腐殖质[18,47]，Nebbioso等[48]将DOM分子划分为氨基酸等小分子量部分(粒径<1 kDa)与腐植酸等大分子量部分(>1 kDa)，因此，4种有机肥大粒径的HIX要高于小粒径。研究表明，生物炭经过高温后，多酚和其他芳香结构组成的类腐殖酸物质在生物炭的制备过程中可能被热解[19, 49]，因此小麦秸秆生物炭的腐殖化程度最低。小麦秸秆生物炭0.2～0.7 μm和100 kDa～0.2 μm粒径DOM的FI<1.4，且BIX<1，这表明小麦秸秆生物炭以外源性DOM为主，受人类活动影响大且自身生产力和微生物活动等贡献相对较低，研究表明，裂解后生物炭DOM的生物活性出现明显下降，裂解过程提高了生物炭稳定性[42]；而虾肽的FI和BIX表明其以内源性DOM为主，自生来源和微生物活动影响明显，类蛋白组分含量高，生物可利用性强。4种有机肥的FI和BIX随着粒径的减小而增大，这与SUVA254、SUVA260和HIX的变化趋势相反，Xu等[21]发现这些荧光指数的变化对DOM的粒径大小具有依赖性，所有样品的HIX值均随粒径的减小而减小，FI和BIX值随粒径的减小而增大，陈雪霜等[50]也有类似的发现，这表明DOM的小粒径成分腐殖化程度较低，蛋白质等微生物活动产生的内源成分含量较多。4种有机肥各粒径的三维荧光组分皆以C1和C2组分为主，即DOM主要为降解的半醌类物质和疏水性的高分子物质，类蛋白成分相对较少。余旭芳等[51]发现在堆肥生产过程中，类蛋白成分 (C3) 减少，C1和C2组分增加。各粒径的荧光组分 (C1 和 C2) 变化类似，在粒径 1～100 kDa最小，在粒径<1 kDa时最大，He等[11]利用尺寸排阻色谱–有机碳检测器(为SEC–OCD)将DOM分为大分子部分(粒径>10 kDa，非腐殖质高分子量亲水性生物大分子，如蛋白质和一些多糖) 和小分子部分(粒径<1 kDa的腐殖质和低分子量有机质，如醛、酮、羧酸等)，这与本研究的结果一致。

4种不同来源有机肥在粒径 <0.7 μm和粒径 <1 kDa下 DOM 的红外吸收曲线特征峰类似，但各官能团的相对含量不同。4种有机肥皆以N―H和O―H键为主，说明4种有机肥含有较多的多糖和碳水化合物，研究表明，有机肥中含有较多的含氧官能团(羧基和羰基)[52]。吴景贵等[53]发现不同有机肥腐解形成的水溶性胡敏酸含有的官能团种类没有显著差别，且随着腐解的进行，其烷基的含量升高，脂族性增强，而且糖类等碳水化合物含量增加。4种有机肥在粒径 <1 kDa时C=C和O―H的含量减少，表明其芳香结构、蛋白质和多糖含量减少，这与SUVA254和HIX在最小粒径出现最小值相对应。小麦秸秆生物炭的两种粒径的官能团相对含量最小，在热解过程中，生物炭的结合水脱离，导致羟基峰下降，进而生物炭DOM中的羟基含量也降低[54–55]。

DOM的生物可利用性与DOM的分子量、极性组分含量有关，分子量越大，极性组分含量越低，其越难被降解[17]，因此，4种有机肥其大粒径组分的SUVA254、SUVA260和HIX要大于小粒径组分，与粒径大小呈现出正相关关系，表明大粒径的DOM芳香化程度、腐殖化程度和疏水组分高，难被降解，生物可利用性低，这也对应了红外光谱4种有机肥在小粒径时C=C和O―H的含量减少，其醇、酚和芳香类物质含量减少；而FI和BIX与粒径大小呈现出负相关关系，表明小粒径类蛋白组分 (C4) 含量高且易被降解。

4 结论

供试4种有机肥各粒径DOC含量差异明显，除海藻外，其余有机肥粒径<1 kDa的组分所占比例皆达到50%及以上。4种有机肥DOM中大粒径组分的SUVA254、SUVA260和HIX值高于小粒径，而FI和BIX值低于小粒径组分。有机肥各粒径DOM主要由降解的半醌类物质和疏水性的高分子物质 (C1和C2组分)组成，类蛋白成分相对较少。小粒径DOM腐殖化程度低，醇、酚和芳香类物质含量少。有机肥的光谱特征表明，小麦秸秆生物炭DOM的生物稳定性要高于其他有机肥，过量施用不利于微生物对土壤有机质的降解利用；而虾肽来源有机肥DOM中的类蛋白组分含量高，生物可利用性高，施用虾肽有机肥可能有利于微生物对土壤DOM的降解利用。