采用网络药理学探讨基于“心肝同治”理论的宣痹通瘀方对冠心病的作用机制❋

李晓辉，彭广操，闫海峰，刘迎辉，刘爱东

(1.河南中医药大学第一附属医院，郑州 450000；2.长春中医药大学，长春 130117；3.长春中医药大学附属第三临床医院，长春 130117)

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)，是指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞，或(和)冠状动脉功能性改变(痉挛)等导致的心肌缺血缺氧或坏死，属于中医学“胸痹”“真心痛”等范畴。近年来研究发现，在心脏代谢疾病的高危人群中，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的患病率达74%[1]。此外，根据颈动脉内膜中层厚度和冠状动脉钙化测量，NAFLD与内皮功能受损、易损冠状动脉斑块患病率及动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)相关[2]。由此推断，肝脏在CHD病程进展中占有重要地位，所以在临床诊疗中调节肝脏功能对改善CHD有一定的帮助。

在治疗疾病过程中，中医药以辨证论治为原则，以病因病机为基础，对病变进行整体治疗。国家名老中医黄永生教授在多年的临床实践中，对于CHD的临床诊治进行了大量的探索，认为肝气郁滞、气机不利是CHD发生发展的一个重要阶段，并指出CHD心绞痛证候可在本虚的基础上出现肝郁气滞。《难经》有云：“假令心脉急甚者，肝邪干心也”；《石室秘录·偏治》亦有云：“人病心痛，不治心而偏治肝”。故黄永生提出“心肝同治”理论，即应从肝治心、心肝双治，并确立了以“疏肝理气，扶助正气，祛瘀生新”为治则的宣痹通瘀方。

网络药理学的应用更能直观体现中医药多层次、多环节、多靶点、多效应等整体治疗优势。故本研究应用网络药理学及分子对接方法，从理论上初步分析宣痹通瘀方的主要活性成分及对CHD和NAFLD的可能作用机制，进一步为以“心肝同治”理论治疗CHD提供物质基础。

1 数据来源与分析方法

1.1 宣痹通瘀方成分及靶点获取

宣痹通瘀方中包含延胡索、三七、川芎、郁金、人参、冰片6种成分，将其分别作为关键词在TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中进行成分及相应靶点的查询及筛选；利用ADME参数口服利用度(bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug like，DL)≥0.18及药物半衰期(drug half-life，HL)≥4 h的化合物作为候选成分，将获取的候选成分导入Unitprot数据库(http://www.uniprot.org/)以“Homo sapiens”为物种获取靶标信息。将从TCMSP数据库查询的化合物分子结构以“mol2”格式导入ALOGPS2.1数据库(http://www.vcclab.org/lab/alogps/)及Swiss Target Prediction数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch)，查询宣痹通瘀方部分活性成分的预测靶点，对预测靶点进行可靠性筛选，筛选条件为可能性>0.1。

1.2 疾病靶点预测

以“coronary heart disease”和“nonalcoholic fatty liver”为检索词在PharmGKB数据库(https://www.pharmgkb.org/)、OMIM数据库(https://omim.org)及DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)检索相关靶点，提取检索出来的所有治疗靶点。

1.3 蛋白互作(protine-protine interaction，PPI)网络构建与分析

将CHD、NAFLD及宣痹通瘀方三者的靶点通过韦恩作图工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)获取交集靶点；继而将交集靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/)，选择“Homo Sapiens”为分析生物体，置信度得分设置为最高(得分≥0.9)之后预测PPI互作关系，进一步使用Cytoscape3.7.2软件进行网络可视化及使用“network analyzer”插件分析PPI的拓扑结构，以网络拓扑参数“连接度(degree)”“紧密度(closeness centrality，CC)”和“介数(betweenness centrality，BC)”的中位数为卡值，选取同时符合3个卡值的节点作为宣痹通瘀方治疗CHD及NAFLD的核心靶点，最后构建“中药-成分-交集靶点”的可视化网络图及核心靶点的PPI网络图。

1.4 多脏腑协同治疗疾病

通过Human eFP在线数据(http://bar.utoronto.ca/efp_human/cgi-bin/efpWeb.cgi)对交集靶点进行基因定位分析，得出不同脏腑所对应的靶点，并将结果可视化。

1.5 分子对接验证

分子对接是通过计算机分析受体特征以及受体和药物小分子之间通过空间匹配和能量匹配而相互识别形成分子复合物，并预测复合物结构的操作过程。基于交集靶点的网络拓扑学分析结果，选取互作关系排名前5位的交集靶点，然后对核心靶点及其对应的药物分子进行分子对接。首先利用TCMSP数据库获得主要药物小分子结构保存为“mol2”格式；基于文献和RSCB PDB(https://www.rcsb.org/pdb/)数据库选择并下载已筛选靶点的3D晶体结构，保存为“PDB”格式。将靶点蛋白导入AutoDock Tools 1.5.6软件，对其进行去水、去配体、加氢并计算电荷，保存为“pdbqt”格式文件；然后导入药物成分的“mol2”格式文件，输出为“pdbqt”格式文件。最后运行AutoDock Vina进行分子对接，计算结合能大小，评估药物化合物与核心靶点之间的结合潜力，采用PyMol软件将分子对接结果可视化分析。

1.6 GO功能与KEGG通路富集分析

利用R软件对药物-疾病交集靶点分析GO功能(生物过程、细胞组分、分子过程)及KEGG信号通路，同时绘制气泡图。

2 结果

2.1 宣痹通瘀方含有的活性成分

利用TCMSP数据库对宣痹通瘀方中6种中药所含的活性成分进行搜索，初步筛选得到的活性成分为延胡索含77个，郁金含222个，川芎含189个，三七含119个，人参含190个，冰片含31个，剔除重复成分共收集到宣痹通瘀方相关活性成分718个。进一步利用ADME参数OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件，筛选出64个候选活性成分，其中延胡索含26个，郁金含12个，川芎含6个，三七含7个，人参含20个，冰片含有3个(见图1)。

注：正方形代表宣痹通瘀方，菱形代表药物，圆形代表成分；药物与其对应成分为同一种颜色，紫色圆形代表药物共同成分

2.2 筛选宣痹通瘀方药物对应靶点

将药物活性成分导入TCMSP数据库初步得出延胡索217个靶点，郁金69个靶点，川芎30个靶点，三七191个靶点，人参118个靶点，并利用Swiss Target Prediction数据库预测郁金、人参及冰片部分活性成分的靶点。由于靶点存在多重对应关系，分析后最终确定为593个唯一靶点。

2.3 宣痹通瘀方与CHD、NAFLD共有靶点

输入关键词“coronary heart disease”和“nonalcoholic fatty liver”于DisGeNET数据库、PharmGKB数据库和OMIM数据库中，剔除无效和重复靶点，最终得到CHD靶点1577个和NAFLD靶点1123个。通过韦恩作图工具制作宣痹通瘀方与CHD、NAFLD三者交集靶标韦恩图，即包含130个共同靶标(见图2)。

注：XBTYF表示宣痹通瘀方，CHD表示冠心病，NAFLD表示非酒精性脂肪肝

2.4 构建药物-成分-交集靶点网络图

构建药物-成分-交集靶点网络图，通过拓扑分析，degree值和CC同时满足前5位的活性成分是槲皮素、积雪草酸、山柰酚、龙脑香醇酮、人参皂苷Rg5，可认为是宣痹通瘀方治疗CHD和NAFLD的关键成分(见图3)。

注：正方形表示药物成分，不同颜色代表不同药物成分，浅绿色为延胡索，墨绿色为郁金，紫色为三七，浅蓝色为川芎，深蓝色为人参，红色为冰片；圆形表示靶点，大小随着degree值大小的改变

2.5 心肝协同治疗疾病

基于eFP浏览器数据库，对宣痹通瘀方治疗CHD及NAFLD的靶点进行器官定位分析(见图4)。这130个靶点普遍存在于人体组织中，表达水平存在一定差异。通过比较靶点的表达水平，观察到心脏存在41个特异性/相对高表达的靶点，肝脏存在62个特异性/相对高表达的靶点，共有18个表达量相近的靶点，9个不表达靶点。由此推测，宣痹通瘀方以“心肝同治”为理论治疗CHD的可靠性。

注：红色三角形表示心脏；绿色三角形表示肝脏；橘色方框表示药物活性成分；红色圆形表示心脏中高表达或特异性表达靶点；绿色圆形表示肝脏中高表达或特异性表达靶点；红绿饼形表示在心脏和肝脏中表达水平相近的靶点；紫色圆形表示均不在心脏和肝脏中表达的靶点

2.6 构建PPI关系网络图

将共有交集的130个靶点导入STRING数据库中，获得相关PPI信息355个，并展示PPI网络图(见图5)。经拓扑参数分析，113个靶点的degree最高值23，中位数为6.28。根据degree值、CC和BC的中位数筛选出21个靶点，依据degree值、CC筛选互作关系前5位的靶点为RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α(phosphoinositide 3 kinase catalytic alpha polypeptide，PIK3CA)、转录因子p65(transcription factor p65，RELA)、细胞肿瘤抗原p53(cellular tumor antigen p53，TP53)，其中AKT1、PIK3CA是心脏高丰度存在靶点，TP53、RELA是肝脏高丰度存在靶点。

注：圆圈为不同靶点，节点大小及颜色由黄色至绿色随degree值高低

2.7 核心靶点与其对应的药物结合能力

选择PPI网络中排名前5位的互作靶点AKT1、TNF、PIK3CA、RELA、TP53，在PDB数据库中检索筛选的靶点受体蛋白结构，与其相应活性成分包括柚皮素、槲皮素、山柰酚、南蛇藤苄酰胺、人参皂苷rh2、五味子酯乙、乙酸龙脑酯等。分子对接表示结合能小于-5说明配体与受体能够自发结合，值越小表示结合活性越高，表明宣痹通瘀方药物成分与关键靶点蛋白具有较强的结合力。分子对接结果显示(表1)，核心靶点蛋白与对应的药物成分能较好地结合，并展示靶点受体蛋白及对应分子成分的最佳对接结果(见图6)。

注：上.3D图；下.2D图；在3D结构图中灰色杆状部分为对接位点

表1 宣痹通瘀方活性成分与靶点受体蛋白的结合能分析(kal·mol-1)

2.8 靶点功能注释分析

将130个共有靶点利用R软件进行生物信息学分析，经富集分析(P<0.05)发现共有生物学过程(biological process，BP)2463个，细胞组分(cell components，CC)72个，分子功能(molecular function，MF)156个。选取P值前15位的条目(见图7)。GO富集分析中生物过程主要涉及对营养水平的反应，对脂多糖的反应、类固醇代谢过程、氧化应激反应及脂质代谢过程等，细胞组分主要涉及膜筏、膜区、小窝、质膜筏及囊腔等，分子过程主要涉及核受体活性、转录因子活性、类固醇结合、细胞因子活性及受体配体活性等。

图7 宣痹通瘀方对靶点的GO富集分析图

经KEGG富集分析(P<0.05)获得165条显著信号通路，根据富集基因数筛选出前45条通路(见图8)。其中主要是流体剪应力与AS、脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信号通路，冠状病毒、缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor，HIF)-1信号通路、NAFLD、乙型肝炎、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路及TOLL样受体信号通路等。

图8 宣痹通瘀方对靶点的KEGG富集分析图

3 讨论

宣痹通瘀方是基于“心肝同治”理论建立的以“疏肝理气，扶助正气，祛瘀生新”为治则的中药复方，方中延胡索有疏肝解郁、活血止痛之功，“治心痛欲死”；郁金能活血行气止痛；川芎通达气血；三七化瘀活血而定痛，使补而不滞、瘀血去则新血生；人参大补元气、益气生津，使心气旺则血运通畅，心络自通，亦可防君臣诸药行气化瘀克罚太过耗伤正气；冰片善走能散，“独行则势弱，佐使则有功”，能开心窍、止痹痛。全方配伍共起疏肝理气解郁、去瘀生新止痛之效，使“肝气通则心气和”。基于前期临床研究证实，宣痹通瘀方对胸痹心痛的患者不仅改善中医症状改善心绞痛，还能降低硝酸甘油使用率[3]。已有研究报道，NAFLD患者即使没有代谢综合征，也比健康人群更容易出现冠状动脉软斑块[4]。有学者推断，肝脏和CHD之间的密切关系可能源于肝脏在糖脂代谢中的核心作用[5]；而在另一项研究中证实，NAFLD中游离脂肪酸增加，导致线粒体功能紊乱和脂肪毒性发生，继而加速心脏病的发生发展[6]。故本研究运用网络药理学及分子对接技术挖掘基于“心肝同治”理论的宣痹通瘀方在治疗CHD的作用机制及深层理论内涵。

通过网络药理学分析可知，宣痹通瘀方含有多种活性成分，包括槲皮素、积雪草酸、山柰酚、龙脑香醇酮、人参皂苷Rg5、乙酸龙脑酯、五味子酯乙、柚皮素等。有研究发现，槲皮素通过改善氧化应激损伤[7]，减少脂质蓄积[8，9]，发挥防治CHD和NAFLD的作用；柚皮素能够通过改善炎症、氧化应激和脂质代谢，减轻AS及NAFLD的病程发展[10，11]；山柰酚通过抗炎、抗氧化及舒缩血管作用来改善AS、CHD、高脂血症及调节肝脏脂质分布[12-14]。通过以上研究证实，宣痹通瘀方中多种活性成分均对CHD和NAFLD有显著的治疗作用。

宣痹通瘀方与CHD、NAFLD三者共有130个靶点，通过PPI分析主要包括AKT1、TNF、PIK3CA、RELA、TP53、白细胞介素(Interleukin，IL)-6、3(MAPK3)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGA)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)等。由eFP基因定位可知，在肝脏存在的高丰度靶点数量略高于心脏中的靶点。通过GO富集分析可知，参与生物过程包括对脂多糖、类固醇代谢、活性氧代谢、氧化应激、脂质代谢、脂肪酸代谢、炎症反应等，细胞组分包括对膜微区、质膜筏、囊泡腔、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物等，分子过程包括对核受体活性、类固醇结合、血红素结合、细胞因子活性、抗氧化活性等。KEGG富集通路分析发现，主要作用通路包括流体剪切应力与AS、NAFLD、PI3K/AKT信号通路、冠状病毒/COVID-19、HIF-1信号通路及TNF信号通路等。

本研究相关结果与文献具有一定吻合度。如研究发现，AKT1不仅在血管重塑、血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖及迁移中起到重要作用[15]，还能通过抑制叉头框转录因子O1改善NAFLD[16]；基于PI3K/Akt途径可调节CHD心肌细胞凋亡[17]，抑制炎症因子表达[18]及促进巨噬细胞自噬[19]，发挥治疗CHD的作用，并能降低肝细胞中甘油三酯的合成与储存[20]，改善自由基诱导的NAFLD[21]。TNF作为一种促炎细胞因子，参与冠状动脉内皮功能障碍过程[22]，增加了CHD急性事件发生的风险[23]；还能激活NLRC4炎症小体，继而加速NAFLD的发展[24]。随着脂肪肝的严重程度，IL-6和TNF-α水平逐渐升高[25，26]，IL-6作为心肌梗死的独立危险因素，与TNF-α在AS形成中具有潜在的直接作用，但也可诱导肝细胞产生C-反应蛋白(c-reactive protein，CRP)，这也可能与AS的发病机制有关[27]。RELA作为核转录因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)家族成员之一，是激活NF-κB的重要亚基。NF-kB激活可显著增加心脏微血管内皮细胞中趋化因子C-X-C配体10的产生，引起并加重心肌梗死[28]。研究发现，NF-κB与细胞摄取氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)相关[29]。当减轻NF-κB p65表达水平，亦有助于减轻肝细胞炎症水平，改善NAFLD病程[30]。Blin等[31]报告说，与已故接受尸检受试者的非AS性冠状动脉组织样本比较，AS性冠状动脉组织中TP53基因的表达增加；同样上调p53途径可促进肝细胞的衰老和凋亡，加速NAFLD的发展[32]。大量研究证实，HIF-1可通过细胞特异性反应在AS的发展中起关键作用，参与巨噬细胞中功能障碍的外排途径等[33]；而在NAFLD中，抑制HIF-2α过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)α途径下调脂肪酸β氧化和肝脏脂肪生成，改善病程的进展[34]。一个亚群的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)反应性T细胞通过抗原识别发展为T滤泡辅助细胞，促进B细胞活化后通过产生G抗体，增强LDL清除率[35]。

综上可知，网络药理学方法在分析中药作用机制方面具有较高的参考价值。由此推测，宣痹通瘀方可通过槲皮素、柚皮素、山柰酚等多成分，作用于AKT1、TNF、PIK3CA、RELA、TP53等多个靶点，通过PI3K/AKT通路、HIF-1通路、T细胞受体通路等多途径，继而对心肝两脏产生多方面影响，以此发挥治疗CHD的作用。本研究的优势在于通过网络药理学及分子对接技术对宣痹通瘀方治疗CHD的作用机制做出了整体性预判和前瞻性预测，不仅阐释了中医“心肝同治”理论内涵，还为该复方的药效物质基础和作用机制提供了依据及参考方向，亦体现出该方多组分、多脏腑、多途径的优势。但本研究仍存在一定的局限性，如仅通过网络药理学和分子对接技术阐释中药复方的活性成分及对接能力，未能体现复方中药在煎煮过程中的相互作用及含量配比等影响。所以，在后续工作中将进一步扩大研究，深入探讨宣痹通瘀方治疗CHD与“心肝同治”理论的内涵。