半仿生酶法提取艾叶挥发油及微囊化制备工艺

黄宇玫，郭建业，袁钰锋，李梦含，蒋柏泉，b

(南昌大学a.科学技术学院，江西 共青城 332020；b.化学化工学院，江西 南昌 330031)

艾叶(又名艾草，艾蒿)具有较高的药用价值，是我国南方很普遍的一种中草药，来源广泛，价廉易得。艾叶含多种生物有效活性成分，其中主要的有效活性成分之一是挥发油。艾叶挥发油主要应用于化工医疗、食品安全、保健等各个领域，是食品、香料和生化工业中的一种重要原料[1]，目前从艾叶中提取挥发油已经成为重要的研究热点之一。

艾叶挥发油成分主要由脂肪类、萜类和芳香类化合物构成，约100余种，主要为桉油精、侧柏酮、龙脑、α-松油醇、β-松油烯、柠檬醛等，因其药效成分复杂，提取得率较低，挥发油味道浓郁且易变质，难以保存。有关艾叶挥发油的化学成分、药理作用的研究较多[2-3]，但其制剂的研究鲜有报道。中药材中植物药占90%，其有效成分大多包裹在细胞壁中，传统的热水、酸、碱、有机溶剂浸提法,因受细胞壁纤维素的阻碍，往往提取效率较低。利用一定量的纤维素酶处理这些中药材，可改变细胞壁的通透性，提高药效成分的提取率。半仿生法是从生物药剂学的角度出发，结合中医所强调的整体观，在传统的分子药物研究法的基础上加入整体药物研究法，对口服药物在胃肠道转运过程的环境加以模拟，用近似胃肠道pH值的酸性或碱性提取液，依次连续提取得到药物中有效成分的提取新技术，这样提取得到的挥发油可以减轻机体消化的负担，更利于人体的吸收[4-5]。艾叶挥发油气味浓郁，易于挥发，微胶囊的作用可以屏蔽味道，改变体积、状态，降低挥发性，起到隔离的作用。

本实验采用酶辅助半仿生法提取艾叶挥发油，确定其最优提取工艺条件，并用复合凝聚法制备艾叶挥发油微胶囊，评价其生物利用率，为后续挥发油产品的开发利用提供一定的理论依据，使艾叶资源具有更广泛的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干艾叶(南阳仙草药业有限公司)；盐酸、无水乙醇、氢氧化钙、甲醇、无水硫酸钠、石油醚(60～90 ℃)、乙酸、氯化钙、硫酸、丙酮，均为分析纯；纤维素酶(酶活力为10 000 U·g-1，福州飞净生物科技有限公司)；胃蛋白酶(国药集团)；明胶、阿拉伯胶(国药集团化学试剂有限公司)。

MH-250型调温型电热套，北京科伟永兴仪器有限公司；PH050A型干燥箱，上海一恒科技有限公司；磁力搅拌器，郑州杜甫仪器厂；BA210型三目显微镜，麦克奥迪有限公司；TDL-50B型离心机，上海一恒科技有限公司

1.2 原料的预处理

将干燥的艾叶用粉碎机粉碎，然后过筛(筛孔尺寸为0.250 mm)，得到艾叶粗粉后贮存备用。

1.3 艾叶挥发油的提取

依据半仿生酶法[6-7]，称取艾叶粗粉10 g，置于250 mL圆底烧瓶中，然后往圆底烧瓶中加入一定量水，调节溶液的pH为2.0,充分震荡使其形成均一相，置于一定温度的恒温水浴锅中加热一定时间后过滤，取出滤液1。将滤渣重新置于圆底烧瓶中，继续加入水一定量，调节溶液的pH为4.5，然后加入0.05 g纤维素酶，充分震荡均匀后，置于一定温度的恒温水浴锅中加热一定时间后过滤，取出滤液2。将第2次分离出的滤渣置于圆底烧瓶中添加水一定量，调节溶液的pH为7.5，然后置于一定温度的恒温水浴锅中加热一定时间后过滤，取出滤液3。将第3次分离出的滤渣置于圆底烧瓶中并添加水一定量，调节溶液的pH为8.3，置于一定温度的恒温水浴锅中加热一定时间后过滤，取出滤液4。将4次提取出的滤液合并，然后用水蒸气蒸馏装置蒸馏，得到油水混合物，加入石油醚用分液漏斗萃取，静置分层，放出下层水分，将上层的有机层倒出，将分液后的石油醚萃取液用无水硫酸钠除去剩余的水分，减压浓缩即得艾叶挥发油，最后将艾叶挥发油称重，计算最终提取率[8]。

艾叶挥发油提取率的计算：

y=m1/m×100%

式中：y为挥发油提取率，%；m1为艾叶挥发油质量，g；m为艾叶粗粉质量，g。

1.4 艾叶挥发油提取工艺的优化

1.4.1 提取温度的选择

取10 g艾叶粗粉，根据上述半仿生酶法的步骤，固定提取时间和料液比，设置水浴温度分别为40，50，60，70，80 ℃，考察不同温度对艾叶挥发油提取率的影响，并确定较适宜的提取温度[9]。

1.4.2 提取时间的选择

取10 g艾叶粗粉，利用上述半仿生酶法的步骤，固定提取温度(1.4.1确定的较适宜提取温度)和料液比，设置提取时间分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，考察不同提取时间对艾叶挥发油提取率的影响，并确定较适宜的提取时间。

1.4.3 料液比的选择

取10 g艾叶粗粉，利用上述半仿生酶法的步骤，固定提取温度(1.4.1确定的较适宜提取温度)和提取时间(1.4.2确定的较适宜提取时间)，设置料液比分别为1:6，1:8，1:10，1:12和1:14，考察不同料液比对艾叶挥发油提取率的影响，并确定较适宜的料液比。

取单因素实验初步确定的较适宜的提取温度，提取时间和料液比作为考察因素，每个因素各选取3个水平，以挥发油提取率为考察目标，采用L9(34)正交实验设计进行实验，确定最佳工艺参数[9]。

1.5 微胶囊的制备与稳定性测试

采用复合凝聚法[10]。该方法是一种将芯材分散在两种带相反电荷的混合壁材溶液中，通过改变体系的pH值、温度等因素，使混合壁材溶液相互作用形成复合物，随后降低溶解度，使其凝聚，析出，形成微胶囊的方法。

1.5.1 明胶-阿拉伯胶混合溶液的制备

称取5 g明胶，加入100 mL蒸馏水，浸泡一段时间使明胶溶胀后于60 ℃下加热溶解，50 ℃下保存备用。称取5 g阿拉伯胶，加入100 mL蒸馏水，40 ℃下加热溶解，45 ℃下保存备用。

45 ℃下两者混合水浴加热。

1.5.2 微胶囊的制备

将4 mL艾叶挥发油滴加到混合溶胶中，45 ℃下水浴加热，滴加6%乙酸溶液，调节pH至4左右，2 500 r·min-1分散3 min。将400 mL 30 ℃左右的温水加入到混合溶液中，1 500 r·min-1下搅拌30 min后，放置于冰浴中降温至10 ℃。随后加入2 mL的37%甲醛溶液搅拌15 min进行固化。加入4%NaOH溶液调节pH值为8，一直搅拌，直至有沉降物析出，静置[11-12]。

待沉降完全后，用滴管吸取上清液，在3 500 r·min-1下离心15 min，最后将得到的微囊用蒸馏水洗至无甲醛味，放入干燥箱中于30 ℃下干燥即得。用吸管取一滴微胶囊悬浮液，滴在载玻片上，显微镜下拍照观察。

1.5.3 稳定性测试方法

模拟胃液的配制：精密量取23.4 mL浓盐酸倒入100 mL容量瓶，加水稀释定容，制成10%稀盐酸溶液。

取稀盐酸1.64 mL于烧杯，加适量水稀释将稀盐酸pH调节为2，加入胃蛋白酶1 g摇匀，溶液转移至100 mL容量瓶，加水稀释定容即得。

模拟胃液耐受性考察:100 mL烧杯中加入1 g微胶囊，加入配置好的模拟胃液10 mL，摇匀，于恒温油浴锅中37 ℃、160 r·min-1，搅拌溶解，每隔半小时调节pH。释放特性：根据以下公式计算微胶囊的释放率。

式中：F为微胶囊释放率，%；mt为时间t内释放的挥发油的质量，g；m0为初始微胶囊中挥发油的质量，g。

贮藏稳定性考察：分别取1 g微胶囊在20，40，60 ℃恒温箱中放置10 h后测微胶囊释放率。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 提取温度的影响

艾叶挥发油提取率随提取温度的变化见图1。

θ/℃图1 提取温度对挥发油提取率的影响Fig.1 Effet of extraction temperature on yield of volatile oil

由图1可知，当提取温度从40 ℃升到60 ℃时,艾叶挥发油提取率随温度升高而提高，且在60 ℃时达最高值，但是当温度从60 ℃升温到80 ℃时，艾叶挥发油提取率呈下降趋势。由此可知，温度升高有利于艾叶挥发油提取率的提高，但温度过高反而会使提取率下降，由于温度过高使酶活性下降，导致分解艾叶细胞壁效果降低。参考同类实验[13]，本实验取60 ℃为较适宜的提取温度。

2.1.2 提取时间的影响

艾叶挥发油提取率随提取时间的变化见图2。

由图2可知，当提取时间从1.0 h增加到2.0 h时，艾叶挥发油的提取率有显著的提高，但当提取时间继续延长至3.0 h后，发现艾叶挥发油提取率变化不大，说明在本实验条件下，当提取时间达到2.0 h时，艾叶挥发油提取率已接近最大值，再增加提取时间意义不大，且增加能源损耗，因此本实验取2 h为较适宜的提取时间。

t/h图2 提取时间对挥发油提取率的影响Fig.2 Effet of extraction time on yield of volatile oil

2.1.3 料液比的影响

艾叶挥发油提取率随料液比ρ的变化见图3。

ρ/(g·mL-1)图3 料液比对挥发油提取率的影响Fig.3 Effet of power/liquid ratio on yield of volatile oil

由图3可知，当料液比ρ在(1:6)～(1:12)范围内，艾叶挥发油的提取率呈上升趋势，且在料液比为1:12时达到最高。由此可知，当料液比高时，艾叶粗粉不能充分与水接触，挥发油浸出量低；随着料液比减小，加入的水量增大，挥发油与水之间两相的接触面积增大，有利于挥发油的自由扩散和溶解析出，使得提取率得以升高。但当料液比小于1:12后，提取率不升反降，且增加能耗。因此本实验取1:12为较适宜的料液比。

2.2 正交实验

在单因素实验的基础上，分别选取提取温度θ=60 ℃、提取时间t=2.0 h和料液比ρ=1:12为中心水平，以提取率为考察目标，进行三因素三水平正交实验设计并开展实验L9(34)，确定艾叶挥发油提取的最佳工艺参数。

正交实验因素与水平见表1。

表1 实验因素与水平Tab.1 Factors and levels of experiment

正交实验结果见表2。

表2 半仿生酶法优化正交实验结果Tab.2 Semi bionic enzyme orthogonal test results

由表2可知，3个因素的极差分别为：提取温度(RA)1.02，提取时间(RB)0.88，料液比(RC)0.57，它们之间的大小关系为RA>RB>RC，由此可得出3种因素对艾叶挥发油提取率的影响大小为：A(提取温度)>B(提取时间)>C(料液比)。表中第5组实验(A2B2C3)所获得的提取率为9组实验中最大(2.20%)，但小于单因素实验较适宜组合(A2B2C2)时的提取率(2.23%)。又根据KA2>KA3>KA1,KB3>KB2>KB1,KC2>KC3>KC1，可得另一可能的最优组合为A2B3C2,但该组合实验未在表2中出现，按此条件做3次平行实验，得平均提取率为2.24%,略高于因素水平组合A2B2C2的提取率。

考虑节省时间和能耗，最终确定酶辅助半仿生法提取艾叶挥发油的最优参数为A2B2C2，即提取温度60 ℃，提取时间2.0 h，料液比1:12，在此条件下可获得较高的挥发油提取率。

2.3 微胶囊性能测试

2.3.1显微镜观察

按1.5.2制备的艾叶挥发油的微胶囊。图4为100倍显微镜下的微胶囊图。

图4 100倍显微镜下艾叶挥发油微胶囊图Fig.4 Microcapsules of Artemisia vulgaris volatile oil at 100x magnification

在显微镜下观察可见，微胶囊呈双层结构，可以清晰地观察到内部包裹着油状液体,包被完整。

2.3.2 载药量

载药量L的计算公式如下：

式中:m3为微囊内药量,g；m2为微囊总质量,g；L为载药量，%。

表3 3次实验的测量结果Tab.3 Result of three experiments

2.3.3 包埋率

包埋率E的计算公式如下：

式中：m5为微囊表面油含量,g；m4为加入总油量，g。

2.3.4 稳定性测定结果

2.3.4.1 对模拟胃液的耐受性

微胶囊在模拟胃液中随时间的变化见表4。

2.3.4.2 在模拟消化液中的释放特性

在模拟消化液中时间与释放率之间的关系见图5。

t/h图5 时间与释放率之间的关系Fig.5 Relationship between time and release rate

不同食物在胃液中停留时间各不相同，水仅停留几分钟，油脂类最长可达5 h，艾叶挥发油微胶囊在模拟消化液中的释放曲线如图5所示，在模拟胃环境中壁材逐渐破裂，在前3 h内由于内外浓度差大，释放速度较快,而后由于胃酸不能完全水解壁材，浓度差降低，挥发油的释放速度明显降低，4 h过后释放量率达到60%后几乎不变，说明在胃液环境中已完成主要成分的释放。

2.3.4.2 稳定性

温度与释放率之间的关系见图6。

θ/℃图6 温度与释放率之间的关系Fig.6 Relationship between temperature and release rate

由于复合壁材在高温情况下遭到破坏，出现缝隙，因此芯材会以一定速度释放，由图6可以观察分析出温度升高到40 ℃之后，阿拉伯胶开始溶解，胶囊壁开始出现裂痕，释放少量芯材，60 ℃后到达明胶熔点后，胶囊壁完全裂解，芯材释放率增加，超过60%，由此可以看出胶囊稳定性很好，常温下因为壁材的保护不易挥发，可以提高挥发油常温的保存率，同时提高了挥发油的热稳定性。

3 结论

以艾叶为原料，通过半仿生酶法提取艾叶挥发油，在设计单因素实验的基础上进一步采用正交实验优化工艺参数。在酶辅助半仿生法提取艾叶挥发油的条件下，发现提取温度对提取率影响最大，其次是提取时间和料液比。确定的最佳提取工艺参数分别是提取温度为60 ℃，提取时间为2 h，料液比为1:12，提取率为2.23%。将提取的艾叶挥发油利用复合凝聚法制备微胶囊，最优的壁材配比为阿拉伯胶与明胶1:1，加入少量吐温，乳化效果更好，用壁材量20%的甲醛进行交联，搅拌转速2 500 r·min-1，包埋率可达到83.5%，效果最佳。经过模拟胃液测试证明制备的微胶囊可以稳定释放，且常温下能够稳定保存，极大地提高了艾叶挥发油的保存率和热稳定性。