D3致密化胚胎的临床结局分析

栾康，姜宏，汪存利，殷慧群，朱杰，曹振毅，吴燕

(中国人民解放军联勤保障部队第901医院生殖医学中心，合肥 230031)

胚胎在种植前经历了受精、细胞分裂、融合、细胞分化及囊腔扩张等过程，人类早期胚胎发育过程中的卵裂球融合(致密化)一般发生于受精后第4天(D4)，D3出现致密化表明其发育进程较快，是胚胎发育过程中的非典型现象，仅有少量报道[1-2]。本文通过回顾性分析同一取卵周期中D3致密化胚与优质卵裂胚的囊胚形成率及临床结局，旨在进一步探讨D3致密化胚的发育及种植潜能。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2014年1月至2021年5月在解放军联勤保障部队第901医院生殖中心行IVF/ICSI助孕的547个取卵周期及其331个移植周期患者的临床资料。

纳入标准：(1)女方年龄<40 岁；(2)D3有致密化胚胎形成。

排除标准：(1)患者染色体异常；(2)中、重度子宫内膜异位症，子宫肌瘤；(3)卵巢功能不全；(4)先天性子宫畸形。

根据D3移植胚胎形态分为致密化胚(包括新鲜及冻融胚胎移植周期)移植组(n=26)和优质卵裂胚(包括新鲜及冻融胚胎移植周期)移植组(n=105)，比较两组的临床结局，并采用二元Logistic回归分析早期流产率的影响因素；根据囊胚移植周期中D3胚胎来源，分为致密化胚来源组(n=67)和优质卵裂胚来源组(n=133)，比较D3致密化胚组与优质卵裂胚组的囊胚形成率及各组的临床结局。

二、研究方法

1.控制性促排卵及体外受精/胚胎培养：采用本中心常规使用的拮抗剂或长方案促排卵[3]，注射HCG后36～38 h经阴道超声取卵，行常规IVF或卵胞浆内单精子注射(ICSI)受精，18～20 h观察原核，G1-plus(Vitrolife，瑞典)培养至D3。

根据细胞数和碎片率评定胚胎质量，分为Ⅰ级(细胞大小均匀，碎片率<5%)、Ⅱ级(细胞大小均匀，碎片率5%～20%)、Ⅲ级(细胞大小不均，碎片率为 21%～50%)和Ⅳ级(细胞大小严重不均，碎片率>50%)。D3胚胎细胞数7～10的Ⅰ级和Ⅱ级胚胎(7/Ⅰ～10/Ⅱ)定义为优质卵裂胚；卵裂球间隙因致密化(形似融合)而界限不清晰，数目难以判断的Ⅰ～Ⅱ级胚胎定义为致密化胚。将细胞数≥4的Ⅲ级以上胚胎转移至G2-plus(Vitrolife，瑞典)中继续培养至第5～6天，并评定囊胚质量[4]，≥2期囊胚纳入囊胚数计算，D5囊胚≥3期、D6囊胚≥4期且内细胞团和滋养层评分不含C级囊胚视为优质囊胚，其余为可利用囊胚。

2.胚胎移植及临床妊娠判定：无新鲜周期移植禁忌证的患者，经医生与患者协商选择移植D3致密化胚或优质卵裂胚，或D5移植优质囊胚或可利用囊胚。对不宜行新鲜周期移植的患者(高OHSS风险、扳机日孕酮水平>4.77 nmol/L、内膜厚度<7 mm、输卵管积水或宫腔积液)，D3玻璃化冷冻1或2枚优质卵裂胚或致密化胚，剩余胚胎行囊胚培养，D5或D6玻璃化冷冻优质及可利用囊胚(激光辅助皱缩后)。解冻周期采用自然周期或激素替代准备子宫内膜。按照玻璃化解冻程序解冻胚胎，培养2 h后观察卵裂胚细胞数及囊胚囊腔恢复情况，选择D3存活致密化胚或卵裂胚及囊腔恢复30%以上囊胚移植。

移植35 d后行B超监测，见孕囊及胎心搏动者判定为临床妊娠，孕12周内自然流产定义为早期流产，妊娠至12周及以上定义为持续妊娠。

三、统计学分析

应用SPSS 21.0 统计学软件进行统计分析。本研究计量资料经Shaqiro-Wilk检验提示均不符合正态分布，故采用中位数(第25百分位，第75百分位)[M(P25，P75)]表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；计数资料采用百分率(%)表示，采用χ2检验或连续校正性χ2检验；多因素影响采用二元Logistic回归分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、D3致密化胚和优质卵裂胚的囊胚形成率及优质囊胚形成率比较

D3致密化胚与优质卵裂胚的囊胚形成率[69.57%(608/874) vs. 67.14%(1 661/2 474)]及优质囊胚形成率[36.16%(316/874) vs. 33.83%(837/2 474)]比较均无统计学差异(P>0.05)。

二、D3致密化胚组和优质卵裂胚组一般资料及临床结局比较

根据D3移植胚胎形态分为致密化胚(包括新鲜及冻融胚胎移植周期)移植组(n=26)和优质卵裂胚(包括新鲜及冻融胚胎移植周期)移植组(n=105)。

1.基础资料：两组患者间年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础性激素水平(FSH、LH、E2)、Gn用量、促排卵方案比较均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 致密化胚组和优质卵裂胚组患者基础资料比较[M(P25，P75)，%]

2.胚胎移植及妊娠结局：两组间新鲜移植周期占比、移植日内膜厚度、移植胚胎数、临床妊娠率、胚胎种植率、持续妊娠率比较，均无统计学差异(P>0.05)，但致密化胚组早期流产率显著高于优质卵裂胚组(P<0.05)(表2)。

表2 致密化胚组和优质卵裂胚组胚胎移植及妊娠结局比较[M(P25，P75)，%]

三、不同胚胎来源囊胚移植患者一般资料及临床结局比较

根据囊胚移植周期中D3胚胎来源，分为致密化胚来源组(n=67)和优质卵裂胚来源组(n=133)。

1.基础资料：两组间患者年龄、不孕年限、BMI、基础性激素水平(FSH、LH、E2)、Gn用量、促排卵方案比较均无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表3 不同胚胎来源囊胚移植患者基础资料比较[M(P25，P75)，%]

2.胚胎移植及妊娠结局：两组间新鲜移植周期占比、优质囊胚占比、移植日内膜厚度、临床妊娠率、胚胎种植率、持续妊娠率比较，均无统计学差异(P>0.05)，但致密化胚来源组移植胚胎数显著低于优质卵裂胚来源组(P<0.001)(表4)。

表4 不同胚胎来源囊胚移植患者胚胎移植及妊娠结局比较[M(P25，P75)，%]

四、D3致密化胚组和优质卵裂胚组早期流产率二元Logistic回归分析

采用二元Logistic回归分析验证D3致密化胚组和优质卵裂胚组早期流产率的影响因素。结果显示，移植胚胎数﹑年龄﹑不孕年限﹑BMI﹑基础FSH﹑基础LH﹑基础E2﹑内膜厚度及促排卵方案对早期流产率均无显著影响(P>0.05)，而移植胚胎质量(优质卵裂胚或致密化胚)是早期流产率的影响因素(P<0.05)(表5)。

表5 D3致密化胚组和优质卵裂胚组早期流产率二元Logistic回归分析

讨 论

胚胎卵裂球致密化起始于8细胞阶段，形成于受精后第4天。此后外层细胞分化为滋养层细胞参与胚胎着床，内层细胞分化为内细胞团发育为胎儿。因此，致密化胚连接卵裂胚与囊胚两个重要胚胎发育阶段，对胚胎发育及着床起重要作用。胚胎质量受患者年龄、促排方案及实验室操作等多种因素影响，D3发生胚胎致密化是一种非典型现象，具体机制尚不明确。培养液为胚胎提供营养物质并维持其发育的微环境。van Langendonckt 等[5]的研究显示，不同种类的序贯培养液D3致密化胚占比存在明显差异，G1.2培养液D3致密化胚占比高于Sydney IVF培养液(9.5% vs. 4.8%)。Fawzy等[6]的研究发现，单一培养液Global/HAS中添加50 ng/ml胰岛素后，D3致密化胚胎占比显著高于未添加组(49% vs. 19%)。同时，国内也有研究显示，单一培养液D3致密化胚占比为10%～15%[7]。上述研究表明，胚胎培养体系能够影响D3致密化胚的占比。另有研究表明，胚胎致密化受多种细胞信号通路调控，相关通路过早激活可使卵裂球间融合提前[8-9]。因此，推测D3致密化胚的形成可能与胚胎培养体系导致相关细胞通路提前激活有关。

关于D3致密化胚临床结局的相关文献较少且结论并不一致。有研究表明移植1枚D3致密化胚临床妊娠率显著高于移植1枚优质卵裂胚(50% vs. 30%，P<0.05)[2]，而刘秀凤等[1]则认为新鲜周期移植1枚D3致密化胚胎与移植1 枚优质卵裂胚的临床妊娠率并无统计学差异。人类卵裂胚约一半以上为非整倍体，而D4桑椹胚具有自我纠正机制，部分包含非整倍体卵裂球的胚胎可形成整倍体囊胚[10-11]。胚胎致密化一般起始于8细胞阶段，但有研究发现，部分胚胎在8细胞之前即开始致密化，而几乎所有提前致密化的胚胎至少有一个卵裂球出现多核[12]，而多核的出现常与胚胎非整倍体﹑低发育及种植潜能差相关[13]。另有研究表明，发育过快或过慢的胚胎非整倍体率均明显增高[14]。因此，胚胎过早发生致密化，胚胎纠错机制未被激活，可能导致D3致密化胚非整倍体率增高。本研究结果显示，D3致密化胚与优质卵裂胚的囊胚形成率及优质囊胚形成率、临床妊娠率、胚胎种植率、持续妊娠率均无统计学差异，但致密化胚组早期流产率显著高于优质卵裂胚组，可能与D3致密化胚非整倍体率较高有关。进一步二元Logistic回归分析也证实，早期流产率与D3移植胚胎质量有关，表明移植D3致密化胚有较高的流产率。

囊胚培养是胚胎的筛选过程，发育潜能较差或染色体异常的胚胎常不能形成囊胚而被淘汰。同时，由于胚胎具有自我纠错机制，囊胚培养过程中部分染色体异常胚胎也可能形成整倍体囊胚[15]。此外，囊胚移植在生理上更接近胚胎自然着床时间，子宫内膜与胚胎发育的同步性更佳，其临床结局明显优于卵裂胚移植[16]。有研究显示，D3低质量胚胎与优质胚胎来源的囊胚其种植率、妊娠率及活产率并无统计学差异，囊胚移植临床结局与 D2或D3 胚胎质量无相关性[17-18]。Egashira等[19]的研究结果显示，冻融胚胎移植周期中移植多核胚胎与正常胚胎来源的囊胚临床妊娠率并无统计学差异(59.1% vs. 52.8%)。本研究结果也显示，移植D3致密化胚与优质卵裂胚来源的囊胚其临床妊娠率、种植率、早期流产率、持续妊娠率均无统计学差异，表明不同形态及质量的卵裂胚发育到囊胚阶段均可获得相似的临床结局，囊胚质量可作为选择胚胎的首选标准。

综上所述，D3致密化胚早期流产率显著高于优质卵裂胚，而发育至囊胚后与优质卵裂胚来源的囊胚妊娠结局相似。因此，D3胚胎移植时应优先选择优质卵裂胚，而致密化胚应行囊胚培养后移植。本研究的样本量较少，研究结果有待大样本RCT研究进一步验证。