基于UHPLC-Q-Exactive-MS/MS的酸枣仁总皂苷对失眠大鼠血清代谢物的影响

张文明，唐静月，费倩倩，卞振华，，袁晓航，陈晓伟，胡敏敏，陆兔林

1.无锡市中医医院，江苏 无锡 214000；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023

失眠是最常见的睡眠障碍性疾病，其主要表现是睡眠质量下降或睡眠时间紊乱。失眠发病原因和机制复杂，心理、生理、环境、药物及多种疾病均可导致失眠。研究表明，失眠不仅与精神障碍（如抑郁、焦虑）有关，亦会导致内分泌失调（如肥胖、糖尿病）和心血管疾病（如高血压、心脏病）。中医药因不良反应少、不易产生耐药性及复发率低等特点，治疗失眠具有一定优势。酸枣仁来源于鼠李科植物酸枣Mill.var.（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子，具有养心补肝、宁心安神、敛汗生津作用。酸枣仁属于原国家卫生部颁布的首批药食同源两用品，截至2016年，共有超过260个改善睡眠的保健产品以酸枣仁及其提取物为原料。酸枣仁总皂苷（Ziziphi Spinosae Semen saponins）是酸枣仁发挥药理作用的主要活性物质，具有镇静催眠、抗抑郁、改善记忆等作用。目前对酸枣仁总皂苷的研究主要集中在提取纯化、成分鉴别和药效学等方面，缺乏关于其进入体内后内源性小分子化合物代谢的研究报道。

代谢组学是一种高灵敏度、高通量的研究体内小分子物质代谢特征变化的方法，可以全面展示代谢物和信号通路的变化及其相互作用。代谢组学的研究模式与中医药整体观相契合，能更加可靠、灵敏地反映疾病或药物作用引起的机体生物功能变化。因此，本研究以对氯苯丙氨酸（PCPA）腹腔注射建立失眠大鼠模型，并进行药效学评价，探讨酸枣仁总皂苷改善失眠的作用，结合代谢组学分析酸枣仁总皂苷干预后大鼠血清代谢物的变化，寻找主要相关靶点和通路，以期为酸枣仁总皂苷药物开发和临床应用奠定基础。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠30只，体质量180～220 g，购于北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2019-0010。饲养于江苏省血吸虫病防治研究所，温度（25±2）℃、相对湿度（55±5）%环境，自然昼夜节律光照，适应性饲养7 d后开始实验。本实验经无锡市中医医院实验动物伦理委员会审批（SKJJ2020011707）。

1.2 药物及制备

酸枣仁饮片（批号19121601，江苏亚邦中药饮片有限公司），经南京中医药大学中药炮制重点实验室陆兔林教授鉴定为鼠李科植物酸枣Mill.var.（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子，符合2020年版《中华人民共和国药典》相关规定。将饮片粉碎，称取适量粉末，加入石油醚（60～90 ℃）索氏提取，制备酸枣仁脱脂粉末。称取适量脱脂粉末，加入8倍量70%乙醇，95 ℃水浴回流3次，每次1.5 h，抽滤，合并滤液，浓缩得浸膏。采用D101型大孔吸附树脂对浸膏进行洗脱，上样液浓度0.05 g/mL，上样速度2 mL/min，上样量40 mL，上样结束静置1 h。以蒸馏水（2 BV/h，3 BV）、30%乙醇（2 BV/h，4 BV）、70%乙醇（2 BV/h，4 BV）分别进行洗脱，收集70%乙醇洗脱液，浓缩干燥即得酸枣仁总皂苷粉末。精密称取酸枣仁总皂苷粉末5 mg置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作为供试品溶液。取酸枣仁皂苷A对照品（批号P13J9S65562，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）适量，加甲醇溶解，制成1 mg/mL溶液，作为对照品溶液。取供试品溶液80 μL置于15 mL试管中，水浴蒸干，加10%香草醛溶液0.5 mL、60%硫酸溶液5 mL，混匀，60 ℃水浴加热15 min，立即用冰水冷却3 min。随行试剂作为空白，分光光度法于波长543 nm处测定吸光度。分别取对照品溶液适量，制成不同浓度的系列对照品溶液，同法测定吸光度，绘制标准曲线，得回归方程＝3.956 2＋0.000 5，R＝0.999 5。计算酸枣仁总皂苷平均含量为50.96%，使用时蒸馏水配制成浓度为10.4 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

PCPA，批号20200914，国药集团化学试剂有限公司；戊巴比妥钠，批号030415，广东台城制药有限公司；甲酸铵，色谱纯，美国Sigma Aldrich公司；甲醇、乙腈、醋酸、甲酸，色谱纯，美国Thermo Fisher公司；其他试剂均为分析纯。Milli-Q 超纯水仪，美国Millipore公司；Vanquish型液相色谱仪，美国Thermo Fischer 公司；Q-Exactive 型质谱仪，美国Thermo Fischer公司；H1850-R型冷冻离心机，湖南湘仪有限公司；QL-866 型混匀仪，美国Vortex Mixer 公司；5305型真空浓缩仪，德国Eppendorf公司；Eclipse CI型光学显微镜，日本尼康公司。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

30只大鼠随机分为对照组、模型组和酸枣仁总皂苷组（ZSSS组），每组10只。模型组和ZSSS组连续3 d腹腔注射PCPA溶液350 mg/kg建立失眠大鼠模型，注射体积10 mL/kg，对照组腹腔注射等量生理盐水。以大鼠出现昼夜节律消失，即白天和夜晚烦躁不安、不断活动，提示模型制备成功。第4日开始，ZSSS组予酸枣仁总皂苷溶液124.8 mg/kg灌胃，体积12 mL/kg，对照组和模型组灌胃等量生理盐水，每日1次，连续7 d。

2.2 一般状态观察

每日早晚固定时间对3组大鼠的行为、精神状况及毛发等一般状态进行观察并记录。

2.3 戊巴比妥钠睡眠实验

末次给药30 min后，参考文献[14]方法，每组取4只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液（35 mg/kg），记录大鼠睡眠潜伏期（给药到翻正反射消失的时间）和睡眠时间（翻正反射消失到翻正反射恢复的时间）。

2.4 取材

给药结束后，各组剩余大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉，腹主动脉取血，室温静置30 min，3 500 r/min离心15 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱保存。迅速分离大鼠下丘脑组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h以上。

2.5 HE染色

将下丘脑组织从4%多聚甲醛中取出，常规脱水，石蜡包埋，切片（厚度4 μm），切片脱蜡至水，行HE染色，脱水封片，置于显微镜下观察。

2.6 代谢组学分析

2.6.1 样品制备

取出大鼠血清，室温解冻。精密吸取100µL血清于2 mL离心管中，加入400µL甲醇，振荡60 s充分混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，分离上清液，真空浓缩干燥。加入150 µL 80%甲醇溶液（含4 ppm PCPA）复溶，0.22µm滤膜过滤，即为待测样品。

2.6.2 仪器条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLCHSS T3色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 µm）；正离子模式流动相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min，2%B；1～9 min，2%～50%B；9～12 min，50%～98%B；12～13.5 min，98%B；13.5～14 min，98%～2%B；14～20 min，2%B）；负离子模式流动相：5mmol/L甲酸铵水（C）-乙腈（D），梯度洗脱（0～1min，2%D；1～9 min，2%～50%D；9～12 min，50%～98%D；12～13.5 min，98%D；13.5～14 min，98%～2%D；14～17 min，2%D）；流速：0.25 mL/min；柱温：40 ℃，进样量：2 μL；离子源：电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式；喷雾电压：3.5 kV（正离子模式）、2.5 kV（负离子模式）；碰撞电压：30 eV；鞘气：30 arb；辅助气：10 arb；毛细管温度：325 ℃。以70 000分辨率进行全扫描，采集范围81～1 000（m/z），高能诱导裂解（HCD）进行二级裂解。

2.6.3 数据分析

采用Proteowizard3.0.8789软件将采集的原始数据导出，利用R语言的XCMS程序进行峰识别、峰过滤、峰对齐等处理，得到代谢组学数据，导入SIMCAP14.1软件进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），筛选变量重要性投影（VIP）＞1且＜0.05的代谢物作为潜在差异代谢物。根据精确分子量（分子量误差≤30 ppm），结合MS/MS碎片信息对HMDB（http://www.hmdb.ca）、Metlin（http://metlin.scripps.edu）、Massbank（http://www.massbank.jp）、LipidMaps（http://www.lipidmaps.org）和mzClound（https://www.mzcloud.org）数据库及自建数据库进行确认注释以获得代谢物。采用Metabo Analyst 5.0（http://www.metaboanalyst.ca/）数据库进行代谢通路分析，使用Cytoscape3.8.2软件绘制代谢网络并进行靶点筛选。

3 统计学方法

4 结果

4.1 酸枣仁总皂苷对模型大鼠一般状态的影响

与对照组比较，模型组大鼠第2～5日行为兴奋，皮毛蓬松且少有光泽，昼夜节律紊乱，第6日开始出现疲劳、精神不振和活动减少现象；与模型组比较，ZSSS组大鼠第2～5日昼夜节律紊乱，兴奋性有所降低，第6日开始攻击行为减少或消失，昼夜节律有所恢复，白天多倦卧，皮毛逐渐恢复光泽。

4.2 酸枣仁总皂苷对模型大鼠睡眠的影响

与对照组比较，模型组大鼠睡眠潜伏期显著延长（＜0.05），睡眠时间显著缩短（＜0.05）；与模型组比较，ZSSS组大鼠睡眠潜伏期显著缩短（＜0.05），睡眠时间显著延长（＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠睡眠潜伏期和睡眠时间比较（，min）

4.3 酸枣仁总皂苷对模型大鼠下丘脑组织病理形态的影响

对照组大鼠下丘脑组织神经细胞丰富，结构完整，分布均匀；模型组大鼠下丘脑组织神经细胞边界模糊，排列松散，有大量碎片细胞；ZSSS组大鼠下丘脑组织神经细胞较丰富，分布较均匀，细胞形态明显恢复。见图1。

图1 各组大鼠下丘脑组织形态（HE染色，×100）

4.4 酸枣仁总皂苷对模型大鼠血清代谢组学的影响

4.4.1 质谱检测结果

将血清样品处理后进行正负离子模式全扫描，样品总离子流图见图2。

图2 各组大鼠血清样品总离子流图

4.4.2 数据模式识别

无监督的PCA可以反映数据的原始状态，有监督的OPLS-DA可直观显示各样品的聚类及变化轨迹。由图3、图4可知，各组样品有聚集成群的趋势，表明各组大鼠血清代谢物产生了一定变化。为进一步筛选大鼠血清潜在差异代谢物，建立组间OPLS-DA模型。结果显示，模型组和对照组、、分别为0.678、0.999、0.640，模型组和ZSSS组、、分别为0.687、0.998、0.631。表示模型预测效果，＞0.5表示模型预测效果较好。由此可知建立的模型可靠，具有良好的预测能力。为避免过度拟合，进行模型验证分析（＝200），模型组和对照组、截距分别为0.986、-0.108，模型组和ZSSS 组、截距分别为0.987、-0.040 4，表示模型与数据的拟合程度，越接近1表明模型拟合越好，截距＜0，表明本研究建立的模型有效，可用于PCPA致失眠大鼠血清差异代谢物的筛选。见图5。

图3 大鼠血清代谢组学数据PCA得分

图4 大鼠血清代谢组学数据OPLS-DA得分

图5 大鼠血清代谢组学数据OPLS-DA模型验证

4.4.3 差异代谢物筛选

在OPLS-DA 基础上，以VIP＞1 且＜0.05 为标准，选择模型组和对照组大鼠血清差异代谢物，进而分析这些差异代谢物在对照组、模型组和ZSSS组的变化，在ZSSS组呈现明显向对照组回调的成分即为潜在差异代谢物，最终筛选出8个潜在差异代谢物，见表2。为更直观显示各差异代谢物的变化，对其进行分层聚类分析，得到热图，见图6。

表2 大鼠血清潜在差异代谢物信息

图6 大鼠血清潜在差异代谢物热图

4.5 代谢通路分析

将筛选的差异代谢物输入Metabo Analyst 5.0数据库进行高通量代谢通路分析，得到3条相关代谢通路，分别为烟酸和烟酰胺代谢（涉及代谢物为1-甲基烟酰胺，其值、影响力值分别为0.075 011、0.138 16）、甘油磷脂代谢（涉及代谢物为乙酰胆碱和甘油磷酸胆碱，其值、影响力值分别为0.013 454、0.048 14）、酪氨酸代谢（涉及代谢物为3,4-二羟基苯乙二醇，其值、影响力值分别为0.197 700、0.012 70）。

4.6 代谢组学网络构建

通过KEGG数据库（https://www.kegg.jp）收集差异代谢物对应的酶和靶点基因，与代谢通路一起导入Cytoscape 3.8.2软件，构建差异代谢物-代谢通路-酶-靶点基因相互作用网络（见图7）。使用Analyze Network插件对代谢网络进行拓扑分析，获得网络中各节点的度值，度值越大，表明其对整个网络的影响越大。度值大于均值（2.952）的潜在差异代谢物有5个，分别是2,3-二羟基苯甲酸、甘油磷酸胆碱、乙酰胆碱、1-甲基烟酰胺和3,4-二羟基苯乙二醇，涉及的代谢通路有甘油磷脂代谢、烟酸和烟酰胺代谢、酪氨酸代谢。度值大于均值的靶点基因有9个，利用度中心性、接近中心性和中介中心性衡量9个靶点基因在网络中的重要性（见表3），这些靶点可能是酸枣仁总皂苷治疗失眠的关键靶点。

表3 酸枣仁总皂苷治疗失眠的潜在靶点基因

图7 酸枣仁总皂苷治疗失眠大鼠差异代谢物-代谢通路-酶-靶点基因相互作用网络

5 讨论

本实验结果表明，酸枣仁总皂苷可明显缩短模型大鼠睡眠潜伏期，延长睡眠时间，改善下丘脑组织病理损伤。为进一步了解酸枣仁总皂苷改善大鼠失眠的作用机制，本研究采用代谢组学技术结合模式识别分析对模型大鼠血清代谢物进行分析，结果得到8个潜在差异代谢物。对差异代谢物进行通路分析和代谢网络分析，得到3条与失眠相关的代谢通路，包括烟酸和烟酰胺代谢、甘油磷脂代谢和酪氨酸代谢。烟酸和烟酰胺代谢、酪氨酸代谢通路＞0.05，但其影响力值较大，研究表明失眠的发生与这2条通路密切相关。

1-甲基烟酰胺具有抗炎和抗糖尿病性脑血管疾病作用，可调节大鼠脑突触体神经递质释放。烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到烟酰胺上，可以认为1-甲基烟酰胺是烟酰胺的主要代谢物。烟酸和烟酰胺是人体辅酶Ⅰ（NAD）和辅酶Ⅱ（NADP）的组成部分，与糖脂代谢、能量代谢、氧化应激和炎症调控等密切相关。研究表明，长期睡眠剥夺使SIRT3 表达显著降低，烟酰胺作为NAD的前体，可以激活NAD-Sirtuins轴，进而上调SIRT1、SIRT2和SIRT3等基因表达。本研究中，与对照组比较，模型组大鼠血清1-甲基烟酰胺水平显著降低；与模型组比较，ZSSS组大鼠血清1-甲基烟酰胺水平显著升高，推测烟酸和烟酰胺代谢途径与失眠发生关系密切，ZSSS可能通过影响1-甲基烟酰胺水平调控烟酸和烟酰胺代谢，从而发挥抗失眠作用。

磷脂酰胆碱与维持细胞膜结构完整性和信号传导功能密切相关。研究表明，甘油磷酸胆碱通过肯尼迪途径刺激磷脂酰胆碱合成，参与维持细胞膜结构的完整性。甘油磷酸胆碱也是神经递质乙酰胆碱的前体，可改善认知功能和学习能力，有研究表明，甘油磷酸胆碱可刺激乙酰胆碱和磷脂酰胆碱的生物合成并激活突触后胆碱能受体，从而增强中枢神经系统的中枢胆碱能功能。本研究显示，模型组大鼠血清甘油磷酸胆碱和乙酰胆碱水平下降，提示大鼠中枢胆碱能功能出现紊乱，酸枣仁总皂苷能上调甘油磷酸胆碱和乙酰胆碱水平，通过调节中枢胆碱能功能紊乱改善失眠。

失眠的发生机制复杂，其中神经递质紊乱被认为与失眠有关。3,4-二羟基苯乙二醇由去甲肾上腺素能神经末梢MAO-A同工酶催化氧化、脱氨基形成，是去甲肾上腺素能神经元内代谢的主要产物。研究发现，PCPA致失眠大鼠血清去甲肾上腺素水平显著升高，去甲肾上腺素是由多巴胺催化产生，对神经活动、大脑皮层的醒觉和睡眠节律等有重要作用。去甲肾上腺素转运蛋白的作用是将神经元释放的去甲肾上腺素摄取回突触前膜。由于3,4-二羟基苯乙二醇来源于去甲肾上腺素能神经元内代谢，因此去甲肾上腺素转运蛋白抑制的结果表现为3,4-二羟基苯乙二醇减少。本研究中模型组大鼠血清3,4-二羟基苯乙二醇水平较对照组显著降低，推测是由于去甲肾上腺素转运蛋白受到抑制，而酸枣仁总皂苷能上调3,4-二羟基苯乙二醇水平。

综上所述，酸枣仁总皂苷能提高失眠大鼠睡眠质量，改善下丘脑病理变化。本研究通过代谢组学技术筛选出与失眠相关的1-甲基烟酰胺、甘油磷酸胆碱、乙酰胆碱和3,4-二羟基苯乙二醇等生物标志物，涉及的代谢通路有烟酸和烟酰胺代谢、甘油磷脂代谢和酪氨酸代谢，GPCPD1、PNPLA6和PLB1等可能是酸枣仁总皂苷调节失眠的关键靶点，其具体作用机制还需实验验证。本研究进一步明确了酸枣仁总皂苷改善失眠的作用机制，可为其药物研发提供依据。