立枯丝核菌对高粱幼苗活性氧及抗氧化酶活性的影响

郭怀刚，赵长江，吴亚滨

(1 河南省农业科学院长垣分院，河南长垣 453400； 2 黑龙江八一农垦大学 农学院，黑龙江大庆 163319)

中国是种植高粱(SorghumbicolorL.)最早的国家之一，目前虽然高粱已不再是主粮作物，但其在农业生产中仍是不可或缺的。高粱抗旱性好，在中国东北、华北、西北干旱地区和盐碱地区的农作物生产体系中具有不可替代的优势，值得一提的是，高粱产业也是国民经济发展所必需的，例如用于酿酒、饲料和能源等[1]。但是，高粱的种植过程中不同病害常年普遍发生，例如立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起的高粱立枯病，发病严重时幼苗枯萎死亡。立枯丝核菌是一种土传病原菌，寄主范围广且腐生性强，广泛存在于大自然界中，可以侵染300多种植物，造成作物减产及品质下降[2-3]。但是，迄今为止未发现对立枯丝核菌免疫的抗性材料，抗性品种的选育和利用十分有限，除了药剂防治外，科研工作者还在生物防治方面进行了探索。例如，在水稻-油菜轮作土壤中发现弯曲芽胞杆菌(Bacillusflexus)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)对立枯丝核菌具有拮抗效应[4]；蚯蚓粪和活性污泥浸提液对立枯丝核菌抑制作用分别可高达78.3%和98.8%，能有效防治马铃薯茎溃疡[5]；利用立枯丝核菌低毒菌株防治有机马铃薯生产中的土传病害，可以减少土传疾病，提高有机马铃薯生产的产量[6]。

其中关于水稻与立枯丝核菌互作机制研究较为系统，取得了长足的进展[2-3]。但是关于高粱与立枯丝核菌互作研究鲜有报道。高卫东等[7]从高粱上得到26个分离物，发现侵染高粱的立枯丝核菌主要有AG-1-IA, AG-4和AG5，其中多数为AG1-IA。其中的优势种群与水稻纹枯病一致[8]，给探讨高粱的抗性机制研究提供了较好的借鉴。本研究以立枯丝核菌AG1-IA侵染高粱，根据侵染时间的不同对高粱生长指标和代谢生理指标进行分析，揭示立枯丝核菌侵染高粱幼苗生理代谢过程，以期为高粱抗性育种和栽培提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 试验材料

立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)‘AG1-IA’由四川农业大学郑爱萍教授惠赠；供试高粱(SorghumbicolorL.)品种‘龙杂19号’由黑龙江省农科院姜艳喜研究员提供。

1.2 植物种植

试验于2017-2018年在黑龙江八一农垦大学黑龙江省秸秆资源化利用工程技术研究中心进行。挑选大小饱满一致无破损的种子，用10% NaHClO消毒15 min，期间不断搅拌，无菌水冲洗4次，于培养箱中28 ℃暗催芽48 h，将芽长一致的高粱种子播种于基质营养土(蛭石∶土=1∶1，V∶V)中，每盆定植20株。生长室培养条件为：昼夜温度(25±2)℃/(20±2)℃，光照14 h，光强1000 μmol·m-2·s-1，相对湿度60%～80%。

1.3 病原菌接种及表型分析

高粱幼苗长至三叶一心时，采用叶鞘牙签嵌入法进行立枯丝核菌菌丝接种，把长满菌丝的牙签嵌入高粱第一片和第二片叶叶鞘中，喷蒸馏水保湿，在28 ℃培养室内的塑料小棚中控温保湿培养72 h。分别在培养6 h(R6)、12 h(R12)、24 h(R24)、48 h(R48)、72 h(R72)和不接菌同期对照72 h(R0)时观测幼苗表型并拍照，同时采用OS-30p叶绿素脉冲制荧光分析仪(美国Opti-Sciences公司)测定功能叶叶绿素荧光参数最大光化学效率(Fv/Fm)，并测定15株幼苗株高、根长、地上和地下鲜/干质量，然后取叶片部分用锡箔纸包裹，投入液氮中速冻，-80 ℃冷藏备用，用于生理指标测定。每个处理3次重复。

1.4 相对电导率

剪取不同处理高粱植株相同叶位的叶片，取相同质量，用去离子水冲洗干净，避开主脉剪成大小适宜的长条。称取0.5 g，置于玻璃试管中，加入10 mL去离子水，试管塞封口，室温条件下静置浸泡24 h，用电导率仪(DDSJ-308F，上海仪电科学仪器股份有限公司)测定浸提液电导率A，然后将玻璃试管置于沸水中煮沸30 min，取出冷却至室温，用电导率仪测定电导率B，重复3次，据此计算相对电导率(A/B×100%)[9]。

1.5 光合色素含量

参照王学奎[10]的方法测定665 nm、649 nm和470 nm波长处测量吸光度值，并计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素(Car)的含量。

1.6 可溶性糖和可溶性蛋白含量

参照刘明杨等[11]用蒽酮法测定可溶性糖含量，在620 nm下测定其吸光度值。参照李合生[12]用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量，在595 nm的条件下测定其吸光度值。

1.7 抗氧化相关指标

(1)丙二醛(MDA)含量：参照Hodges等[13]用硫代巴比妥酸法测定，在450 nm、532 nm、600 nm下测定其吸光度值。(2)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性：参照Jiang等[14]的氮蓝四唑法测定，在560 nm波长下测定其吸光度值。(3)过氧化氢酶(catalase, CAT)活性:参照Jiang等[14]的方法测定，在240 nm波长下测定其吸光度值。(4)抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性:参照Jiang等[14]的方法测定，在290 nm的波长下测定其吸光度值。(5)过氧化物酶(peroxidase, POD)活性:参照Chen等[15]的愈创木酚法测定，在470 nm的波长下测定其吸光值。

1.8 活性氧相关指标

1.9 数据分析

利用Excel 2010对数据进行整理和图表制作，利用SPSS 21软件进行单因素方差分析，采用Duncan’s检验法进行多重比较及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 立枯丝核菌接种对高粱幼苗生长的影响

与对照(R0)相比，高粱幼苗在接种立枯丝核菌48 h表现出明显的症状，接种72 h所有高粱幼苗因接种部位坏死而表现为枯死、垂折表型(图1)。同时，随病程的发展接菌高粱幼苗株高、根长、地上(茎和叶片)鲜质量和干质量、地下(根)鲜质量和干质量均随着接种时间延长呈下降趋势，且各指标在R24、R48和R72处理时均显著降低，其中在R72时较对照分别下降了41.0%、29.2%、50.0%、50.0%、53.3%和50.0%(表1)，说明立枯丝核菌侵染会阻碍高粱生物量的积累，影响植株正常生长。

表1 接种立枯丝核菌后高粱幼苗生物量的变化

表2 接种立枯丝核菌后高粱幼苗叶片光合色素含量和Fv/Fm的变化

2.2 立枯丝核菌接种对高粱叶片叶绿素含量和最大光化学效率的影响

由表2可知，与对照(R0)相比，接种高粱叶片叶绿素a含量随处理时间延长逐渐降低，在R24、R48和R72显著降低，降幅分别达到1.7%、7.3%和45.3%；然而，叶片叶绿素b和类胡萝卜素含量却呈现增加趋势，两种色素含量在R72处理中分别显著增加35.2%和19.1%。说明立枯丝核菌侵染高粱后显著影响光合色素的含量，且随发病严重度逐渐明显。进一步分析接种后高粱幼苗叶片Fv/Fm，且随立枯丝核菌株接种时间的增加呈逐渐下降趋势，在R24、R48和R72时较对照分别显著下降了14.0%、42.3%和70.9%。由此可见，病菌侵染高粱会导致叶片最大PSⅡ的光能最大光化学效率下降。

2.3 立枯丝核菌接种对高粱幼苗叶片丙二醛含量和相对电导率的影响

与对照(R0)相比，处理组高粱叶片中MDA含量和相对电导率随立枯丝核菌接种时间增加均呈逐渐上升趋势，且在R24、R48和R72处理下均与对照差异显著。其中MDA含量分别显著上升了32.7%、128.8%和244.6%(图2，A)，相对电导率分别相应显著上升了72.0%、120.4%和149.1%(图2，B)。可见，病菌侵染导致高粱膜质发生氧化损伤、膜透性增大。

2.4 立枯丝核菌接种对高粱幼苗叶片超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量的影响

总体来看，处理组高粱幼苗叶片内活性氧含量随病程的发展逐渐显著增加。在R24、R48和R72处理下，超氧阴离子自由基产生速率较对照分别显著上升了109.7%、68.3%和140.4%(图2，C)，过氧化氢含量则分别显著上升了82.8%、147.0%、137.0%(图2，D)。说明病菌侵染导致高粱幼苗体内超氧阴离子自由基和过氧化氢含量显著升高。

2.5 立枯丝核菌接种高粱幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

与对照(R0)相比，接种病菌高粱叶片中抗氧化酶活性随病程的发展均发生了显著变化，除POD外，SOD、CAT和APX活性变化趋势相似，即都出现低于对照的处理点(图3)。其中，SOD活性呈先上升后下降再上升的趋势，R24和R72分别显著增加了8.3%和16.5%，而R48显著下降了11.3%(图3，A)；POD活性呈先上升后下降的趋势，但均不同程度地高于对照，在R24、R48和R72分别显著上升了34.5%、63.8%和60.3%(图3，B)；CAT和APX活性呈先下降后上升的趋势，并均在R24处理下达到最低值，两种酶活性在R12～R48时分别较对照显著降低了9.1%～68.2%和44.2%～78.8%，在R72处理时较对照分别显著增加了50.0%和36.5%(图3，C、D)。由此可见，病菌接种致使高粱幼苗体内抗氧化酶活性不同程度增强，用于清除ROS，维持体内ROS稳态，避免膜的氧化损伤。

2.6 立枯丝核菌接种对高粱幼苗叶片可溶性物质含量的影响

与对照(R0)相比，随病程的发展处理组高粱幼苗叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量均呈逐渐上升趋势，且R24、R48、R72处理差异显著(图4)。其中，可溶性蛋白含量分别显著上升了10.0%、14.3%和21.0%(图4，A)，可溶性糖含量则分别显著上升了73.4%、152.8%和216.7%(图4，B)。表明病菌侵染引起高粱体内蛋白和糖含量增加，以利于寄主抵御病菌侵染。

3 讨论与结论

立枯丝核菌有较高的侵染性，当病原菌接触感知植物信号，刺激菌体产生侵染结构，并通过分泌蛋白实现穿透寄主植物表面，建立寄生关系的目标[17]。本研究以立枯丝核菌侵染高粱，在不同侵染时间考察高粱生长指标的变化，发现接种立枯丝核菌可致高粱植株产生病斑，阻碍高粱生物量积累，影响植株正常生长，且随接种时间的延长危害加重。结合前人研究立枯丝核菌可减少光合色素含量，阻碍植物生物量积累[18-19]的结论，推测立枯丝核菌对植株生长的负面影响具有普遍性。

植物受病原菌侵染后会启动体内的抗病反应机制，植物体内产生一系列复杂的生理生化变化，主要体现为一些防御酶活性发生变化。据报道，立枯丝核菌侵染大豆时，大豆植株体内的超氧阴离子和H2O2水平呈现上升趋势，随后体内一些防御酶POD、CAT和SOD等活性均明显增强[20]；玉米接种立枯丝核菌后，其SOD活性表现为先增加后降低的趋势，而POD活性呈逐渐增加趋势[21]。本研究结果表明，接种立枯丝核菌24 h后SOD、POD酶活性开始增强，说明此时植株体内已积累过量活性氧，而APX和CAT酶活性随接菌时间的增加均呈先下降后上升趋势，可能是植株内原有酶含量消耗到一定程度，刺激植株自身免疫系统，酶活增强，提高清除活性氧能力。同时，本研究中立枯丝核菌侵染高粱植株后，使植物发生膜脂氧化现象，导致MDA含量増加、膜结构破坏，细胞内液外流，这也是导致细胞浸出液电导率上升的直接原因，与立枯丝核菌在水稻方面的相关研究结果一致[22]。

前人研究表明，马铃薯接种立枯丝核菌后块茎可溶性糖与可溶性蛋白含量发生显著变化[23]，玉米纹枯病使叶片可溶性糖含量、总蛋白质和总脯氨酸含量上升[24]。本研究发现，当高粱幼苗受到立枯丝核菌菌丝侵染后，在侵染前期宿主体内可溶性蛋白和可溶性糖含量增加，说明高粱植株受到立枯丝核菌侵染带来的伤害时，以积累更多渗透调节物质来保持细胞持续生长，保护抗氧化酶活性、维持细胞膜稳定性。

综上所述，接种立枯丝核菌可致高粱幼苗植株产生病斑，体内活性氧过量积累，膜质发生显著氧化损伤；而宿主植株可积累更多可溶性糖和可溶性蛋白等渗透调节物质和刺激植株自身免疫系统，诱导宿主体内抗氧化酶类SOD、POD、APX和CAT等活性增强，以维持高粱体内活性氧代谢稳态平衡，减少植物膜进一步氧化损伤。