大鼠类胚体的制备及实时观察

李家瑞， 徐 彧， 徐海瑾， 李建宁， 李 岩， 宋 辉， 杨 怡

（1.宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，银川 750004； 2.宁夏医科大学内分泌学研究所，银川 750004；3.宁夏医科大学基础医学院医学遗传学与细胞生物学系，银川 750004）

大鼠是第一种用于科学研究的哺乳动物，因其生理调节能力和药理反应等方面与人类相似[1]，常作为动物模型广泛地应用于生理、药理与毒理研究。但大鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的建立直到2008 年才得以成功[2]。ESCs 能够分化为机体所有类型细胞[3]，为研究再生医学[4-5]和发育生物学提供了丰富的细胞来源。ESCs 的体外分化通常需要先形成类胚体（embryoid bodies，EBs）[5]，EBs 是三维的细胞聚集体，含有3 个胚层的所有细胞类型[6]。体外形成的EBs通过定向诱导分化的方法，可以获得个体发育早期体内的一些前体细胞群[7]，如心肌细胞[8-9]、神经细胞[10]、血细胞[11]、胰腺细胞[12]等。课题组前期研究发现，使用小鼠EBs 的诱导方法将大鼠ESCs 诱导分化为EBs 的过程中细胞死亡率极高，获得EBs 的数量也无法满足后续实验的需要。因此，有效地生产大鼠EBs，是使用大鼠ESCs 定向分化成所需细胞类型进行相关科学研究的关键。本研究通过悬滴法和悬浮法[13]将大鼠ESCs 制备为EBs 并连续培养10 d，在第5 天和第10 天对其进行形态学观察、直径测量、数量统计以及特异性基因与蛋白表达的检测，对两种方法得到的EBs 进行比较，了解两种方法的优劣，筛选在不同情况下更适宜的EBs 制备方法，为通过EBs 途径体外分化特定类型细胞用于临床疾病的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

荧光定量PCR 仪、酶标仪、电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；核酸超微量仪（德国GE 公司）；化学发光成像仪（美国Azure 公司）；倒置荧光显微镜（德国Leica 公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo Pisher Scientific 公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.2 主要试剂

BCA 蛋白检测试剂盒与全蛋白提取试剂盒（江苏凯基公司）；10%PAGE 凝胶快速制备试剂盒与蛋白Maker（中国雅酶公司）；逆转录试剂盒与RT-qPCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司）；稳定性ECL 发光液（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；丝裂霉素C（美国Sigma 公司）；DMEM、DMEM/F12、Neurobasal、MEM Non-Essential Amino Acids、N2、B27、L-Glutamine、β-mercaptoethanol、青霉素链霉素双抗生素溶液、胎牛血清（美国Gibco 公司）；引物合成（上海生工公司）；OCT4 与Naong 抗体（美国Affinity 公司）；Nestin 与AFP 抗体（SAB 公司）；Brachyury、GAPDH、山羊抗兔IgG 与山羊抗兔IgG/Cy3 抗体（Bioss 公司）；CHIR99021与PD0325901（美国APExBIO 公司）。

1.3 饲养层的制备

将小鼠原代胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）培养至第3 代，待MEF 长满瓶底时向培养基中加入丝裂霉素-C（Mitomycin-C），终浓度为10 μg·mL-1，37 ℃、5%CO2培养箱中放置2 h。然后将MEF 消化为单细胞悬液，接种于提前用明胶处理1 h 以上的六孔板中，培养箱中培养备用。

1.4 ESCs 的培养

将ESCs 接种在饲养层细胞上，放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中，每天换液。ESCs 细胞培养基为N2B27 培养基，并添加3 μmol·L-1CHIR99021和1 μmol·L-1PD0325901。N2B27 培养基成分主要由250 mL DMEM/F12 与Neurobasal 培养基，5 mL 非必需氨基酸、N2 与谷氨酰胺，10 mL B27以及3 μL β-mercaptoethanol 组成。

1.5 类胚体的培养

将培养至第3 代的ESCs 用胰酶消化，移入明胶处理过的培养皿中沉降20 min 左右，在光学显微镜下观察MEF 贴壁后，将未贴壁的ESCs移入15 mL 的离心管离心，留下细胞沉淀。悬浮法[13]：用类胚体培养基（N2B27 培养基添加0.75 μmol·L-1CHIR99021 和0.25 μmol·L-1PD 0325901）重悬沉淀的细胞，转入90 mm 低黏附性无菌培养皿中，隔天换一次液；悬滴法[13]：用类胚体培养基重悬沉淀，用移液枪吸取35 μL 细胞悬液，滴加到90 mm 低黏附性无菌培养皿的皿盖上，每滴间隔约0.5 cm，重复此操作直至皿盖滴满，快速将皿盖翻转过来，盖到加有PBS 或蒸馏水的90 mm 低黏附性无菌培养皿上，培养2 d后转为悬浮培养。

1.6 RT-qPCR 检测ESCs 与EBs 的特异性基因

运用TIANGEN 总RNA 提取试剂盒提取悬浮法培养第5 天（xf5）、第10 天（xf10）以及悬滴法培养第10 天（xd10）的类胚体和ESCs 的RNA，用TaKaRa 反转录试剂盒合成cDNA，按照TaKaRa RT-qPCR 试剂盒说明书进行RT-qPCR实验，检测各组样品的基因表达水平，引物序列见表1。

表1 大鼠ESCs 向EBs 分化过程中相关基因引物

1.7 Western blot 检测ESCs 与EBs 的特异性蛋白

采用凯基全蛋白提取试剂盒提取xf5、xf10以及xd10 的类胚体和ESCs 的总蛋白，并使用凯基BCA 蛋白含量检测试剂盒进行定量。用雅酶10%PAGE 凝胶快速制备试剂盒制备凝胶并电泳，然后将其转移至PVDF 膜上。以GAPDH（1∶5 000）为内参，以兔一抗OCT4（1∶1 000）、Naong（1∶1 000）、Nestin（1∶1 000）、AFP（1∶1 000）以及Brachyury（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。山羊抗兔IgG二抗（1∶3 000）室温孵育1 h。将ECL 发光液滴加在蛋白条带上，放入蛋白成像系统中检测并记录蛋白条带。

1.8 免疫荧光检测EBs 的表面抗原

4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS 漂洗3次。0.5% Triton 穿孔10 min，PBS（0.05% triton-100/PBS）漂洗5 次，5%山羊血清封闭30 min，以GAPDH（1∶300）为内参，孵育兔一抗OCT4（1 ∶300）、Naong（1∶300）、Nestin（1∶60）、AFP（1∶60）以及Brachyury（1∶300），4 ℃过夜。PBS 漂洗3 次，孵育山羊抗兔二抗IgG/Cy3（1∶400）（避光操作），室温1 h，PBS 漂洗3 次。5 μg·mL-1Hoechst 33342染色10 min，PBS 漂洗3 次，荧光显微镜下观察拍照。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用成组t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用Dunnett-t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCs 形态学观察及多能基因mRNA 和蛋白水平的检测

在倒置显微镜下观察发现，大鼠ESCs 贴附在饲养层上，克隆状分布，细胞间界限清晰，呈圆形或椭圆形，边缘较光滑，轮廓清晰，见图1A。RT-qPCR 结果表明，诱导制备的ESCs 和EBs 均能够表达多能基因Naong 和OCT4，但随着培养时间的增长，多能基因表达逐渐降低，与ESCs 相比，EBs（xf5、xf10 和xd10）中OCT4 与Naong 基因的表达量均降低（P 均<0.05），见图1B。Western blot 结果显示，ESCs 中多能蛋白Naong 和OCT4的表达量均高于EBs（xf5、xf10 和xd10）（P 均<0.05），见图1。

图1 ESCs 形态学观察及多能基因OCT4 与Naong mRNA 和蛋白检测

2.2 EBs 形态学观察、数量统计及直径检测

在倒置显微镜下观察，EBs 呈圆形或椭圆形球体，边缘光滑，细胞间联系紧密。随后对形成的EBs 进行计数与直径测量，结果显示，悬滴法制备的EBs 生成率低于悬浮法（P 均<0.01），但同质性更好，而悬浮法制备的EBs 数量更多，操作更为简便，见图2。

图2 EB 形态学观察、数量统计及直径检测

2.3 RT-qPCR 检测EBs 特异基因表达水平

悬浮法制备的EBs 成功表达AFP、Gata-6、cdh1、Gata-1、Mixl1、Brachyury、Nestin、VIM 等 三胚层基因，并且随着EBs 培养天数的增加，内胚层基因AFP 表达升高（P<0.05），Gata-6 和cdh1 的表达无明显变化（P＞0.05）；中胚层基因Brachyury表达降低（P<0.05），Gata-1 和Mixl1 表达无明显变化（P＞0.05）；外胚层基因VIM 表达降低（P<0.05），Nestin 表达无明显变化（P＞0.05），见图3A。RT-qPCR 结果显示，xf10 的EBs 三胚层基因表达均高于xd10 的EBs（P 均<0.05），见图3B。

图3 RT-qPCR 检测EBs 特异基因表达

2.4 Western blot 检测EBs 特异蛋白与表面抗原表达水平

悬浮培养的EBs 随着培养天数增加，内胚层蛋白AFP 表达增强，中胚层蛋白Brachyury 表达下降，外胚层蛋白Nestin 表达略有增加；而同时期xf10 的EBs 三胚层蛋白表达均高于xd10 的EBs。通过细胞免疫荧光检测EBs 表面抗原发现，EBs 能够表达特异蛋白Naong、OCT4、AFP、Nestin与Brachury 等，见图4。

3 讨论

ESCs 具有发育的全能性，能够分化为机体所有类型的细胞，尽管存在伦理问题[14]和异体移植的免疫排斥反应[15]，但ESCs 仍是细胞疗法最有希望的细胞来源。目前，ESCs 的体外分化方式主要有两种，第一种为单层黏附培养[16]，即让ESCs在贴壁的培养环境下，通过向培养液中添加生长因子及其他种类化学诱导剂，或者将ESCs 与其他种类细胞共培养[17]，使ESCs 向某种特定类型细胞定向诱导分化。第二种是让ESCs 在高密度的环境中过度生长，形成三维结构即EBs，以启动分化，这种分化方式更加稳定且分化效率更高。

研究表明，EBs 分化的主要影响因素包括培养基组成[18]、细胞数量[19]、EBs 大小[20]和EBs 形态[21]。EBs 大小会直接影响其向下游分化的结果[22]，可能是EBs 中单个细胞对微环境的感知和应激造成的。当EBs 超过一定的大小范围时，这种影响更加明显，EBs 外围的细胞倾向于分化为原始内胚层细胞[23]，而EBs 中心的细胞则倾向于形成原始的外胚层细胞。不同形态的EBs 也表现出不同的分化倾向[21]。

本研究对两种方法制备的EBs 进行了形态学观察、数量统计与直径检测，发现悬滴法培养的EBs 直径大、同质性好，但生成效率低；而悬浮法培养的EBs 直径小、同质性差，但生成效率高，适宜大量制备。随后对EBs 三胚层特异基因与蛋白的表达进行了检测，发现悬浮法比悬滴法培养的EBs 三胚层特异基因与蛋白表达更高，这可能是悬浮法培养的EBs 分化不同步，包含多种类型导致的。

除此之外，EBs 的培养时间也可能对后期分化产生影响。目前，大多数通过EBs 途径进行体外定向诱导分化的实验，是将EBs 培养至5～10 d 进行贴壁分化培养[19]。本研究通过悬浮法培养将大鼠ESCs 制备为EBs 并培养至第10 天，对培养第5 天和第10 天的EBs 进行比较，通过RTqPCR 检测发现，EBs 均可表达AFP、Gata-6、cdh1、Gata-1、Mixl1、Brachuny、Nestin 与VIM 等三胚层基因，证明EBs 可以分化为机体所有类型细胞。另外，随着EBs 培养时间的增长，不同时期的EBs三胚层基因表达发生了变化。EBs 内胚层基因表达增加，而外胚层与中胚层基因表达逐渐减少，说明EBs 三胚层基因表达具有时间性。

综上所述，悬滴法可以控制EBs 形成时的起始细胞数，从而得到大小均一、发育同步的EBs，更为适合体外分化实验，但一次难以制备大量EBs；悬浮法可以制备大量的EBs，但所获EBs 差异大，发育不同步。研究[24]表明EBs 大小与均匀性将影响ESCs 的体外定向诱导分化。总而言之，本文通过两种方法成功制备了大鼠EBs，并且发现EBs 培养时间的不同也对EBs 体外分化具有很大的作用，对今后通过EBs 途径进行体外分化实验具有一定的研究价值与参考意义。