基于血清4型禽腺病毒fiber-1蛋白间接ELISA检测方法的建立

武晓倩，谢芝勋，罗思思，韦 悠，邓显文，李小凤，万丽军，曾婷婷，谢丽基，任红玉 (1.广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530004；.广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001)

心包积液-肝炎综合征(hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)由血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)引起[1]，该病于1987年在巴基斯坦安卡拉地区首次报道，随后蔓延到世界各地[2]，2015年起在中国多地暴发[3]。发病鸡临床表现为嗜睡、羽毛蓬松、精神沉郁和排黄绿色稀粪等症状，剖检特征为心包有淡黄色积液，肝脏肿大黄染等[4]。HHS既可水平传播也可垂直传播，甚至可形成气溶胶在空气中传播[5]，传染力强、死亡率高，给养禽业造成巨大经济损失，因此建立简便快速的诊断方法十分重要。目前诊断HHS的方法主要有分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)等[6]，这些方法准确快速，但成本高昂，对检测人员要求较高。酶联免疫吸附测定(ELISA)方法操作简单，成本低廉，特异性好，适用于进行大规模的血清学检测，所以建立能够快速准确检测FAdV-4抗体的ELISA方法对该病的防控意义重大。

I群禽腺病毒根据血清交叉中和试验，可细分为12个血清型(1～7、8a、8b、9～11)[7]。FAdV-4编码hexon、penton、fiber-1、fiber-2 4个主要的结构蛋白，hexon和penton蛋白与其他血清型同源性都较高。宋文平等[7]研究发现hexon蛋白与其他血清型均有交叉反应。fiber-1和fiber-2蛋白仅与FA-dV-10同源性较高，与其他血清型同源性较低[9]。因此，用fiber蛋白作为包被抗原检测FAdV-4抗体可能具有更好的特异性。此外，fiber-1蛋白是病毒复制的必需蛋白。PAN等[10]发现FAdV-4利用fiber-1结合宿主细胞CAR的D2结构域，完成病毒与宿主细胞的结合；fiber-1蛋白还能诱导机体产生针对FAdV-4的特异性抗体，具有良好的免疫效果[11]，但目前基于fiber-1蛋白作为检测抗原的相关研究还较少。因此本试验成功原核表达fiber-1重组蛋白，并以此为包被抗原，建立了检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法，为该病的防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 毒株与主要试剂FAdV-4毒株由本实验室分离、纯化、鉴定和保存；FAdV-1、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-10阳性血清及SPF鸡阴性血清由本实验室制备；鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、H5和H9亚型禽流感病毒(AIV)阳性血清由本实验室保存；pET-32a载体、DNA提取试剂盒、高保真酶、Trans 5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术公司；DNA连接试剂盒、20T载体、EcoRⅠ、XhoⅠ内切酶购自宝生物工程(大连)公司；氨苄青霉素、X-gal、IPTG、10%蛋白预制胶、高效RIPA裂解液、考马斯亮蓝快速染色液等购自北京索莱宝科技有限公司；质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒购自OMEGA公司；His标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪公司；HRP标记山羊抗鸡二抗，ECL超敏化学发光试剂盒购自宝生物工程(上海)有限公司。

1.2 引物设计参考GenBank已经公布SD1601/FAdV-4毒株(登录号：MH006602.1)fiber-1基因序列，设计1对特异性引物，上游引物5′-CCGGAATTCATGTCGGCCCTAATCGC-3′；下游引物：5′-GGGCTCGAGTTAGGGGCCCGGAGCATT-3′，下划线斜体部分分别为EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点，引物由华大基因有限公司合成，目的片段长度1 296 bp。

1.3 fiber-1基因的克隆按DNA提取试剂盒说明书操作，提取FAdV-4基因组DNA。以基因组为模板扩增fiber-1基因。将PCR产物凝胶回收，连接到20T载体上，转入Trans 5α感受态细胞，鉴定阳性菌并送生工测序正确后，用EcoRⅠ和XhoⅠ 将pET-32a载体和fiber-1质粒37℃双酶切3 h;酶切产物凝胶回收后在16℃下连接14 h;连接产物转化BL(21)DE3感受态细胞，取阳性克隆菌经双酶切鉴定，送生工测序。测序结果用MegAlign软件中的Clustal W方法比对分析，确保重组质粒构建成功。

1.4 fiber-1重组蛋白的诱导表达及诱导条件优化将测序正确的阳性菌液按1%比例接种10 mL含氨苄青霉素的LB肉汤培养基，培养14 h后，留5 mL 作为种子液，余下5 mL与甘油混合后置于-80℃ 保存。以1∶100接种Amp+LB培养基，37℃摇床培养4 h，加入0.6 mmol/L的IPTG，分别诱导表达1，2，3，4，5，6，7 h，诱导结束后取菌液沉淀，超声裂解后进行SDS-PAGE电泳分析，筛选出最佳诱导时间；加入IPTG至终浓度分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L以最佳诱导时间诱导，处理菌液进行SDS-PAGE电泳，用BandScan 4.3软件进行分析，筛选最佳IPTG诱导浓度。

1.5 fiber-1重组蛋白的可溶性鉴定和纯化以最佳条件诱导5 mL菌液，离心后用PBS重悬菌体沉淀，加入溶菌酶和蛋白酶抑制剂，反复冻融3次后在冰上超声裂解菌体至溶液清澈，离心后取上清和沉淀SDS-PAGE电泳，确定表达产物的存在方式。根据蛋白纯化试剂盒说明书，诱导600 mL菌液，离心后加入10倍沉淀体积的裂解液，冰浴超声处理至无沉淀，4℃高速离心，用10倍沉淀体积的binding buffer充分溶解沉淀，离心15 min，取上清液上柱，与镍柱填料充分混合后静置分层，收集流穿液，用15倍柱体积的binding buffer冲洗柱子，再用咪唑终浓度为25，50，75，100，125，150，175，200，250，300 mmol/L的elution buffer依次洗脱，分管收集，每个梯度约5 mL。SDS-PAGE电泳确定重组蛋白纯化效果，选择纯度较高的蛋白样品进行透析复性，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

1.6 Western blot鉴定纯化后样品经SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜，用5%脱脂奶封闭3～4 h后，用FAdV-4阳性血清1∶200稀释作为一抗，HRP标记的山羊抗鸡二抗1∶4 000稀释，进行Western blot鉴定，ECL超敏化学发光试剂盒进行显色，观察结果。

1.7 fiber-1-ELISA反应条件优化

1.7.1抗原最佳包被质量浓度和血清最佳稀释度的确定 利用方阵试验初步确定包被抗原和一抗最佳稀释度：将重组蛋白倍比稀释为32，16，8，4，2，1 mg/L，每个梯度包被1列，阴、阳性血清稀释为1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，每个稀释度包被1行，按间接ELISA程序操作。重复3次，选择阳性血清D450 nm接近1，P/N最大的孔所对应的条件为最佳条件。

1.7.2酶标二抗稀释度、包被条件、封闭时间、一、二抗和显色时间的确定 依次对酶标二抗稀释度、抗原包被时间、封闭时间、一、二抗作用时间和显色时间进行优化筛选，确定fiber-1-ELISA的最佳反应程序。

1.9 特异性试验用建立的ELISA方法检测抗FAdV-1、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-10、NDV、IBDV、IBV、ARV、AIV-H5、AIV-H9阳性血清，设阴性对照，判定fiber-1-ELISA方法的特异性。

1.10 敏感性试验随机选择3份FAdV-4阳性血清分别进行1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200稀释，按ELISA最佳反应程序进行检测，确定fiber-1-ELISA方法的敏感性。

1.11 重复性试验随机选取10份阳性血清，使用同一批次制备的抗原包被板，在3个不同时间检测，每次设3个重复孔，进行批内重复性试验；在3个不同批次制备的抗原包被板上，同一时间对样品进行检测，进行批间重复性试验。

1.12 临床样品检测采用fiber1-ELISA方法检测广西某鸡场采集的12日龄样品30份，31日龄样品32份，44日龄样品31份，22周龄样品83份，总计176份鸡血清样品进行检测，分析流行情况。

2 结果

2.1 fiber-1基因扩增及克隆鉴定结果PCR扩增后，用琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带大小约1 296 bp，与预期一致(图1A)，克隆至pET-32a载体后进行双酶切鉴定，得到1 296，5 866 bp 2个片段(图1B)。阳性克隆菌送生工测序，测序结果表明目的基因成功连接至pET-32a载体。

A.fiber-1基因扩增(M.DL2000 DNA Marker；1～4.fiber-1基因扩增产物)；B.pET-32a-fiber-1的双酶切鉴定(M.DL10000 DNA Marker；1.pET-32a； 2.pET-32a-fiber-1的双酶切产物)图1 pET-32a-fiber-1重组质粒的构建

2.2 诱导条件优化结果以不同时间和不同IPTG浓度诱导重组蛋白后，SDS-PAGE电泳，经BandScan 4.3软件分析表明当IPTG终浓度为0.6 mmol/L，37℃诱导4 h时，重组蛋白表达量最高(图2)。

A.最佳诱导时间筛选(M.蛋白Marker；1.空菌体表达产物；2～8.诱导1，2，3，4，5，6，7 h的表达产物)；B.最佳IPTG浓度筛选(M.蛋白Marker；1.空菌体表达产物；2～7.IPTG浓度0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L的表达产物)图2 pET-32a-fiber-1 蛋白最佳诱导条件筛选

2.3 可溶性分析和纯化结果经SDS-PAGE电泳分析，表达产物主要在沉淀，以包涵体形式表达(图3A)；纯化后，在咪唑终浓度为100 mmol/L的洗脱液洗脱后得到较纯且较浓的目的蛋白(图3B)，经BCA试剂盒测定蛋白质量浓度为256 mg/L。

A.pET-32a-fiber-1蛋白可溶性鉴定(M.蛋白Marker；1.全菌体；2.诱导菌液上清；3.诱导菌液沉淀)；B.pET-32a-fiber-1蛋白纯化结果(M.蛋白Marker；1.空菌体对照；2.pET-32a-fiber-1纯化前；3～7.纯化后)图3 pET-32a-fiber-1 蛋白的SDS-PAGE分析

2.4 Western blot鉴定Western blot检测结果显示，重组蛋白与FAdV-4阳性血清有特异性反应，表明重组蛋白有良好的反应原性(图4)。

M.蛋白Marker；1.fiber-1蛋白；2.阴性对照图4 Western blot 鉴定结果

2.5 fiber-1-ELISA方法的建立

2.5.1抗原最佳包被质量浓度、血清最佳稀释度的确定 经过反应条件优化，确定当pET-32a-fiber-1重组蛋白包被质量浓度为4 mg/L，一抗血清稀释为1∶200时，P/N值最大。

2.5.2酶标二抗稀释度、包被条件、封闭时间、一、二抗和显色时间的确定 经试验得出二抗最佳稀释度为1∶10 000；抗原最佳包被条件为37℃包被1 h后4℃静置14 h；最佳封闭时间为60 min；一、二抗最佳作用时间分别为60，30 min；TMB最佳显色时间为9 min。

2.7 特异性试验用建立的fiber-1-ELISA方法，检测FAdV-1、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-10、NDV、IBDV、IBV、ARV、AIV-H5、AIV-H9阳性血清，除FAdV-4、FAdV-10外，其他阳性血清D450 nm值皆低于0.314，表明本试验建立的方法特异性良好(图5)。

图5 fiber-1-ELISA 特异性试验

2.8 敏感性试验将随机选择的3份阳性血清1∶1 600稀释后，D450 nm值均大于0.314，仍为阳性。1∶3 200稀释后，D450 nm值都在临界值以下(图6)。

图6 fiber-1-ELISA敏感性试验

2.9 重复性试验该方法批内最大变异系数为7.1%，批间最大变异系数为6.9%，皆小于10.0%，表明建立的方法具有良好的重复性(表1)。

表1 fiber-1-ELISA批内和批间重复性试验结果(n=10)

2.10 临床样品检测用本试验建立的fiber-1-ELISA方法检测广西某鸡场采集的176份临床样品，结果如表2所示，共检出阳性样品75份。

表2 不同日龄鸡血清FAdV-4抗体检测结果

3 讨论

在Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型中，FAdV-1与肌胃糜烂(AGE)有关，FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11通常诱发包涵体肝炎(IBH)，而FAdV-4引起心包积液-肝炎综合征(HHS)[12]。自2015年以来，HHS在中国山东、河南等多个省份相继暴发[13]，2016年3月在广西地区有疑似病例出现，发病急，死亡率高，给养禽业造成严重威胁[14]。建立一种能快速特异性检测FAdV4抗体的ELISA方法是十分必要的。

既往研究中，PAN等[15]使用高纯度和高浓度的FAdV-4病毒粒子作为包被抗原，建立了通用ELISA方法，无法特异性检测FAdV-4；许多以重组hexon蛋白为包被抗原的ELISA检测方法也未说明能够区分禽腺病毒的其他血清型[16-17]。相比之下，fiber蛋白作为诊断抗原在敏感性和特异性上更佳。梅楠等[18]以重组fiber-2蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法，与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8、FAdV-9和FAdV-11无交叉反应。HAO等[19]基于FAdV-8的fiber蛋白建立了特异性检测FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b的ELISA方法，与其他型无交叉反应。本试验以重组fiber-1蛋白为包被抗原，建立了检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法，只与FAdV-4与FAdV-10发生特异性反应，不与其他常见禽病的阳性血清反应，也不与FAdV-1和FAdV-8a抗体发生交叉反应。fiber-1-ELISA方法与FAdV-10发生反应的原因可能是同属于禽腺病毒C种，同源性高，序列差异小，具有相同的抗原表位，该结果与SHAO等[20]报道的一致。

fiber蛋白在病毒感染和发病机制中起着重要作用，被证明具有良好的免疫保护效果，也可以将FAdV-4与其他血清型的禽腺病毒区分开来[21-24]。本试验成功构建了pET-32a-fiber-1重组质粒，获得了高效表达的fiber-1重组蛋白。不同IPTG浓度诱导的蛋白量差别不大，肉眼较难区分，但未用IPTG诱导的表达量明显较低，可见IPTG的诱导作用显著。表达产物以包涵体形式存在，原因可能是37℃条件下蛋白表达量过高，合成速度太快，没有足够时间折叠。本试验采用梯度洗脱的方法得到了理想纯度的蛋白，透析复性效果也较好。Western blot结果显示fiber-1重组蛋白具有较好的反应原性，可作为检测抗原。本试验表达的重组蛋白也可以用于制备单克隆抗体，进行更多关于fiber-1蛋白的结构及其功能研究。

FENG等[25]研究发现FAdV-4对鸡的致病性表现出年龄相关性，小于59日龄的鸡表现出100%的发病率和死亡率，而180日龄的鸡仍然会感染，但致病性显著降低。本试验检测了不同日龄的176份血清样品，12日龄30份样品皆为阴性，31日龄阳性率为37.5%，44日龄样品中阳性率为58.0%，表明该鸡场低日龄鸡群中存在腺病毒感染，应加强防控。

综上所述，本试验成功在大肠杆菌中表达并纯化了fiber-1重组蛋白，并建立了检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法，该方法特异性强，敏感性高，重复性好，可应用于检测临床样品，进行免疫后抗体水平监测，评估免疫效果，为HHS的防控提供技术支持。