大豆凝集素诱导动物肠道损伤的抗营养机制的研究进展

刘佳伟，赵进鹏，鄂天姣，潘 丽，鲍 男，赵 元，秦贵信 (吉林农业大学 动物科学技术学院 吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林 长春 130118)

大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)是大豆中主要的抗营养因子，比其他豆科植物凝集素更稳定，SBA在体外和体内条件下都能抵抗蛋白酶的降解[1]，未消化的SBA结合到肠道上皮细胞表面，与肠道上皮细胞发生特异性结合，产生抗营养作用，影响肠道结构和消化功能[2]。SBA的抗营养作用与其含量[3]、动物的种属有关[4]。关于SBA的研究，秦贵信等[5]曾进行过较为全面的归纳和总结，王利民[4]对SBA在不同种属动物间抗营养机制的差异进行了比较。从SBA对上皮细胞影响的研究中发现，SBA会改变上皮细胞的结构，增加上皮细胞的通透性[6]。不仅如此，SBA还可以改变细胞的形态、诱导上皮细胞发生凋亡和自噬、阻滞细胞周期正常生长[7-8]、引起细胞迁移[9]。本研究主要从细胞生物学和分子生物学的角度总结了SBA的抗营养机制。

1 SBA的理化特性及生物学功能

SBA是指可与N-乙酰基D-半乳糖胺/D-半乳糖发生特异性结合，相对分子质量约120 kDa的一类糖蛋白，由4个亚基组成[10]，每个亚基都含有1个与动物蛋白中相似的寡糖链[3]，通常由约250个氨基酸的单一多肽链组成[11]。每个亚基都有1个紧密连接的Ca2+和Mg2+，这2个离子之间距离为4.25 Å，并且与结合位点非常接近，可以直接或者间接通过水分子正确提供定位，为糖基结合提供所需框架，是SBA与糖蛋白结合的必要条件[12]。

SBA的基本生物学功能是凝集动物红细胞和促进细胞增殖[5]。研究证明植物凝集素能够与红细胞表面特定的糖类反应，SBA能与细胞膜上的受体分子形成交联，引起红细胞凝集反应[13]。在物理或化学因素的诱导下使SBA聚合时，SBA单体间发生相互交联，增加与红细胞反应的位点，使SBA的凝集活性增强[14]。不同种属动物中，其凝集作用也有显著性差异，SBA对动物红细胞的凝集反应中，从高到低依次为兔、猪、山羊、鸡、鹅、犬[15]。SBA不仅可以凝集动物红细胞，也可以与淋巴细胞表面形成的受体发生特异性结合[16]，改变膜结构触发淋巴细胞有丝分裂的信号[17]，与淋巴细胞的凝集作用可促进淋巴细胞的增殖[18]，对不同动物而言淋巴细胞的增殖影响不同，从高到低依次是兔、犬、猪、羊。对同一种动物其T淋巴细胞增殖功能影响大于B淋巴细胞增殖功能[19]。低质量浓度的SBA有利于促进细胞的生长，如质量浓度小于5.00 g/L的SBA能促进兔小肠上皮细胞的增殖[20]，质量浓度小于2.00 g/L 的SBA能促进大鼠上皮细胞的增殖[21]。

2 SBA的抗营养作用

SBA可以与小肠上皮细胞发生特异性结合产生抗营养作用。SBA在进入胃肠道内后，抵抗了胃肠道内的蛋白酶，与肠道上皮细胞发生特异性结合[1]，对动物的肠道结构和功能产生影响，导致了一系列的抗营养作用[22]，主要表现为动物内源氮损失[23]，如胰腺增生[24]，生长体质量下降，引起动物腹泻[25]，甚至死亡。

大鼠日粮中SBA超过0.40 mg/g时，会增加内源性氮的损失，降低表观氮消化率、留存率和氮平衡值。日粮中SBA超过2.00 mg/g时，胰腺的RNA和DNA含量随着日粮中SBA水平升高而增加，甚至导致胰腺肿大[26]。当SBA占饲料营养水平0.15%和0.20%时，大鼠的体质量均低于正常生长水平，随着SBA所占饲料营养水平的增加，大鼠体质量呈线性下降[27]。

SBA的抗营养作用不仅与饲料中其含量有关，还与动物的种属有关。据王利民[4]研究，在不同种属动物及其消化道的不同部位内，SBA的免疫活性残留规律是不同的，总体看小肠内残留率，从高到低依次是羊、鸡、猪、犬、兔。SBA对单胃动物的影响明显大于反刍动物，SBA在反刍动物小肠中的吸收率和吸附率均低于单胃动物，SBA还有可能被瘤胃微生物分解[28]。

2.1 SBA对肠道组织结构和功能的影响SBA对肠道的影响更为显著，研究证明SBA在动物肠道中与消化道表面结合，通过胞饮作用内化，引起上皮细胞微绒毛萎缩，增加隐窝深度，降低动物对日粮中营养物质的消化和吸收能力。如SBA与大鼠小肠上皮细胞结合，导致绒毛萎缩，增加隐窝深度，并且提高了隐窝细胞的生产率，改变了肠黏膜原有的结构和功能[26]。随着日粮中SBA的增加，空肠绒毛长度呈线性减少，隐窝深度和隐窝细胞数呈线性增加。SBA与大西洋蛙和虹鳟鱼的小肠微绒毛结合后，也会影响肠道结构和功能[29]。

SBA对小肠刷状缘酶活性有较大的影响，SBA会抑制肠上皮细胞酶的活性[30]，如十二指肠刷状缘肠激酶[31]、空肠和回肠的刷状缘麦芽糖酶和蔗糖酶、以及肠黏膜分泌的肠激酶和碱性磷酸酶等。火鸡日粮中SBA含量分别为0.024%和0.048%时，可显著抑制小肠刷状缘膜上蔗糖酶和麦芽糖酶的活性[32]。大西洋鲑鱼长期饲喂含有SBA的饲料，也会降低麦芽糖酶的活性[33]。除了抑制刷状缘上酶的活性,SBA可能会减弱有关酶的合成，阻碍正常营养物质的消化吸收[34]。

不仅如此，SBA还干扰了肠道菌群的生态平衡，仔猪日粮中添加纯化的SBA会增加回肠中挥发性脂肪酸的含量，增强其菌群活性[35]。用豆粕代替75%的鱼粉蛋白会对微生物的相对丰度产生不利影响，特别是对乳球菌、地质杆菌、链球菌、芽孢杆菌和不动杆菌等属的影响会更大[36]。肠道菌群的改变可能是SBA与小肠上皮的结合改变了小肠原有的黏膜结构，使某些微生物在肠道表面的附着位置发生了改变，从而刺激了细菌的生长。另一方面，细菌生长所需的额外营养物质可能是由凝集素对肠道的负面作用所产生，如介导的黏液高分泌、上皮细胞丢失、血清蛋白流失、饲料养分消化率减少等[35]。

2.2 SBA对肠道上皮细胞生物学功能的影响

2.2.1SBA对肠上皮细胞增殖的影响 在体内试验中，向大鼠饲喂低水平的纯化SBA日粮，SBA的含量在0.4～2.0 mg/g范围内，大鼠小肠质量、空肠干重、蛋白质、DNA、RNA和多胺(腐胺、亚精胺、精胺)会随SBA的含量升高而增加，表明低水平的纯化SBA(0.4～2.0 mg/g)大鼠日粮会诱发小肠实质性增生，并随着日粮SBA水平的提高，这种增生更加明显[37]。SBA增加小肠腺窝细胞的数量，小肠绒毛中未成熟细胞的比例提高。其他植物凝集素，如花生凝集素(PNA)、菜豆凝集素(PHA)、伴刀豆凝集素(ConA)、麦胚凝集素(WGA)，均能不同程度地引起全肠外营养大鼠胃肠道上皮细胞增生[38]。

通过体外试验发现，SBA对猪的肠道上皮细胞的增殖也会产生负面影响，SBA通过显著降低细胞周期蛋白CDK4、Cyclin E和Cyclin D1 mRNA的表达量，干扰正常上皮细胞有丝分裂G1期向S期时的细胞周期进程，使上皮细胞周期停滞于G0/G1期，从而减少细胞的有丝分裂，抑制上皮细胞增殖[39-40]。

2.2.2SBA对肠上皮细胞凋亡的影响 SBA会阻滞仔猪上皮细胞由G1期向S期转变，使小肠上皮细胞周期停滞于G0/G1期，从而减少细胞的有丝分裂，表现为细胞凋亡[6]。SBA通过诱导促炎细胞因子(肿瘤坏死因子α、IL-6和IL-1β)的表达，以及利用谷氨酸或谷氨酰胺作为ATP产生的底物。谷氨酰胺代谢间接影响Krebs循环和随后的呼吸链，进而刺激活性氧(ROS)的产生，从而诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡[41]。

豆类凝集素可以通过凋亡的方式诱导癌细胞死亡[42]。如四季豆凝集素通过P53(Ser46)磷酸化诱导结肠癌细胞，在细胞周期中G0/G1期发生停滞，使其细胞凋亡[43]。豌豆凝集素诱导埃利希腹水癌细胞，使其细胞周期阻滞于G2/M期产生凋亡[44]。7-羟基香豆素将肺腺癌细胞的周期阻滞在G1期，诱导细胞凋亡[45]。

此外其他凝集素也可以诱导细胞凋亡，如马铃薯凝集素诱导艾氏腹水癌细胞，使其细胞在G2/M周期停滞来抑制细胞生长[46]。辣木籽凝集素通过调节Bak和NF-β的基因表达，诱导艾氏腹水癌细胞凋亡抑制生长[47]。苦瓜籽凝集素抑制艾氏腹水癌细胞的生长，也是通G0/G1期细胞周期阻滞[48]。其他植物凝集素在诱导细胞凋亡时，与豆科植物凝集素有相似之处。

2.2.3SBA对肠上皮细胞迁移的影响 SBA促进肠上皮细胞由隐窝向绒毛顶端的迁移速度增加，质量浓度低于1.5 g/L的SBA对细胞的迁移有促进作用，并且在相同作用时间内，细胞迁移数量随质量浓度的增加而加强[49]。不仅如此，当大鼠角膜内皮细胞表面受到损伤时，SBA也会与细胞表面发生结合，来破坏肌动蛋白的组织，影响ZO-1的存在和损伤后单层重塑过程中细胞连接的重建，甚至改变迁移细胞的形态，使其细胞呈锥形，细胞突起变少或变钝[50]。SBA还可与大鼠乳腺癌淋巴细胞结合，促进淋巴细胞迁移，并且和高水平SBA结合的细胞比例与淋巴迁移转移频率呈线性相关[54]。

2.3 SBA诱导肠道上皮细胞损伤的机制SBA通过对肠道上皮细胞造成的损伤从而产生抗营养作用。一方面，SBA会破坏肠道上皮细胞的结构，损伤细胞的完整性和通透性。另一方面，SBA通过诱导细胞的结构蛋白来影响肠道上皮细胞的生物学功能，阻碍正常的细胞周期过程，此外SBA还可以通过其他的凋亡、自噬和信号传导等途径来改变细胞活性。

SBA会破坏肠道上皮细胞的结构，增加小肠上皮细胞膜的通透性，降低肠上皮细胞形成的免疫机械屏障。据PAN等[7]研究表明，SBA可以改变仔猪肠道上皮细胞的形态，相邻细胞之间的边界出现模糊，随着SBA浓度的增加，增殖细胞数量会显著减少，与此同时，也检测到细胞外AP的活性增加，细胞TEER值也会降低。SBA会降低Occludin 与 Claudi-3的相对表达量，降低细胞间的紧密连接(TJs)，增加上皮细胞的通透性；这间接性说明SBA对细胞膜的完整性和通透性造成不同程度的损伤[51-52]。

SBA也通过诱导一些细胞结构蛋白来改变肠道上皮细胞的生物学功能。SBA可通过与α-actinin-2结合，从而间接地改变整联蛋白的功能和表达量，进而影响细胞的增殖、周期和凋亡[7,53]。细胞骨架蛋白角蛋白8、角蛋白18和肌动蛋白参与了SBA引起的小肠上皮细胞的生物学功能改变过程(周期和凋亡)，这3种细胞骨架蛋白的活性位点可能因SBA与细胞骨架蛋白结合封闭，细胞骨架蛋白的表达被抑制，从而引起细胞骨架塌陷，同时可能会增加细胞表面死亡受体，导致细胞周期阻滞和凋亡增加[54]。

SBA除了直接影响肠上皮细胞的结构和生物学功能外，这些效应可以扩展到引起细胞凋亡、自噬和信号转导。SBA通过线粒体介导的途径改变细胞活性。SBA通过产生ROS诱导HeLa细胞凋亡和自噬死亡[55-56]。SBA诱导IPEC-J2F细胞凋亡并降低Bcl-2 mRNA表达[7]。

从蛋白质组学分析表明，SBA诱导的差异表达蛋白的数量主要富集于DNA复制、碱基切除修复、细胞核切除修复、错配修复、酰胺和肽生物合成、泛素介导的蛋白质水解、以及线粒体和核糖体的结构和功能。综上所述，在细胞中SBA的抗营养机制是一个复杂的过程。这种过程包括与DNA相关的活动、蛋白质合成与代谢、Signal-conducting关系以及亚细胞的结构和功能[57]。

其他豆科植物凝集素诱导的细胞凋亡、自噬或两者兼而有之，其诱导途径主要通过线粒体介导、死亡受体和特异性结合等。ConA通过Caspase-dependent途径诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡，也可以通过内化和线粒体介导途径诱导肝癌细胞自噬[58]。ConA通过下调生存信号NF-kβ、ERK、JNK和Akt介导不同信号通路来诱导细胞凋亡[59-61]。ConA可通过线粒体介导的途径诱导肝癌细胞自噬及细胞死亡[62]。花生凝集素通过产生ROS诱导HeLa细胞凋亡和自噬死亡[63-64]。已有报道苦参凝集素(SFL)通过Caspase-dependent途径诱导肿瘤细胞凋亡，其凋亡机制可能是死亡受体途径[65]。菜豆凝集素通过糖特异性结合诱导L929细胞Caspase-dependent凋亡[66]。

植物凝集素是一类高度多样化非免疫来源的可与碳水化合物相结合的蛋白，可诱导细胞凋亡、自噬或凋亡、自噬同时进行。在大量研究中发现，植物凝集素有很多不同的途径消除各种类型的癌细胞，主要包括直接核糖体失活、内吞依赖的线粒体功能障碍、含糖受体结合以及介导死亡受体的途径[66-67]。例如植物凝集素诱导细胞凋亡和自噬的机制可能是由于凝集素对Bcl-2、自噬分子、Caspases、p53、ERK、Ras-Raf、BNIP3和ATG家族蛋白表达的影响[68-69]。甘露糖特异性凝集素通过死亡受体介导的Caspase-dependent途径诱导HeLa细胞凋亡[65]。玉竹凝集素(POL)通过Ras-Raf-MEK-ERK信号通路诱导人MCF-7乳腺癌细胞凋亡和自噬[70]。槲寄生凝集素(VCA)通过控制线粒体途径诱导人肝癌细胞凋亡，该途径不依赖于p53途径和p21途径[57]。从有关的研究显示，植物凝集素不仅对动物细胞结构有直接影响，而且对细胞的生物学功能也会产生影响。

3 展望

SBA作为大豆中的抗营养因子，阻碍动物正常的消化吸收和营养代谢，还会影响动物的身体健康，抑制动物的生长发育。随着对SBA抗营养作用机制的不断深入研究，对于SBA的抗营养作用在同种动物的不同生长阶段和不同种属动物之间的差异规律，以及对肠道结构和小肠上皮细胞生物学功能之间的影响提供了理论依据，为阻断或降低SBA抗营养的技术研发提供了新思路。这些研究对实现饲料资源的合理利用和饲料加工技术的优化具有重要意义。另一方面，利用SBA对细胞表面糖蛋白的识别，可与细胞特异性结合，并且具有诱导细胞凋亡、自噬等生物学功能，可作为人类癌症细胞的示踪指标以及抑制或清除肿瘤细胞的靶向药，对医学方面抗癌肿瘤研究也具有重要的意义。