基于PI3K/Akt 通路豨莶草抗脑缺血再灌注损伤作用机制研究

王文杰 徐煜彬 徐珊珊▲

1.浙江省台州市中心医院（台州学院附属医院）神经内科，浙江台州 318000；2.浙江省台州市中心医院（台州学院附属医院）药剂科，浙江台州 318000

脑卒中具有发病率高、病死率高、致残率高及复发率高的特点，恢复缺血区域的脑灌注是脑卒中治疗的核心问题，而这也可能诱发进一步的组织损伤和功能障碍，即脑缺血再灌注（IR）损伤。IR 损伤在脑卒中的发病机制中起着至关重要的作用，因此，减少IR损伤是治疗脑卒中的关键。

豨莶草出自《唐本草》，宜用于风湿痹症、痿证及中风等。现代药理学研究证实豨莶草具有改善微循环、抗血栓等作用，临床主要用于脑缺血、冠心病等治疗。本文基于PI3K/Akt 通路研究豨莶草抗IR 的作用机制，为豨莶草后续开发及临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 大鼠40 只，雌雄各20 只，平均体重（200±20）g，购自维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 药物及试剂

豨莶草购自台州爱康大药房；IL-1β、IL-6、NFκB 和TNF-α 试剂盒购自南京建成生物有限公司；兔抗大鼠PI3K、Akt 购自美国CST 公司，RT-qPCR 试剂盒购自南京Vazyme。

1.3 动物分组及给药

首先随机将40 只大鼠分为假手术组、模型组和豨莶草水煎液低、中、高剂量组（分别相当于生药0.45、0.90、1.35 g/kg），每组各8 只。给药组分别灌胃给予豨莶草0.45、0.90、1.35 g/kg，或相同剂量的生理盐水（模型组和假手术组），连续灌胃给药14 d 之后采用改良线栓法进行造模，详见参考文献。

1.4 神经功能缺损评分

参照Longa 等神经功能缺损标准对IR 24 h 后的大鼠进行评分。

1.5 病理检测

IR 24 h 后，各组大鼠随机抽取2 只处死于冰面上取出大脑组织，固定于4%多聚甲醛溶液并制备石蜡切片，采用苏木素-伊红染色，检测其病理变化。

1.6 RT-PCR 和Western-blot 检测

IR 24 h 后，随机在各组抽取3 只大鼠，取出脑组织的缺血部分50 mg，采用Trizol 提取RNA，按照试剂盒说明进行逆转录，用于qPCR 反应。PCR 引物序列见表2。IR 24 h 后，取出脑组织的缺血部分50 mg，加入1 ml 的裂解液提取蛋白进行电泳，转膜，封闭1 h，孵育一抗，4℃过夜，洗膜后孵育二抗2 h 后显影成像，详见文献。

表2 PCR 引物序列

1.7 ELISA 检测

再灌注24 h 后，参照操作说明采用ELISA 法检测各组大鼠缺血脑组织中的IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 神经功能缺损评分

IR 24 h 后，神经功能缺损评分如下：假手术组为（0.00±0.00）分，模型组为（2.75±0.46）分，显著高于假手术组（P＜0.01）；0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨莶草组分别为（2.12±0.64）分及（1.50±0.53）分，与模型组相比显著降低（P＜0.05 和P＜0.01），而0.45 g/kg 豨莶草组为（2.50±0.53）分，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 豨莶草水煎液对IR 模型大鼠脑组织病理变化的影响

HE 染色结果发现假手术组大鼠脑组织并无异常，模型组和0.45 g/kg 豨莶草组均可见大量炎性细胞浸润；而0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨莶草组大鼠脑组织可见少量炎性细胞浸润。见封三图3。

2.3 豨莶草对IR 模型大鼠脑组织PI3K 和Akt mRNA 表达的影响

与假手术组相比，模型组PI3K 与Akt mRNA 表达显著上升（均P＜0.01）；而0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨莶草组较模型组显著降低（均P＜0.01）。见表3。

表3 豨莶草水煎液对IR 模型大鼠脑组织PI3K 和Akt mRNA 表达的影响（）

2.4 豨莶草对IR 模型大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量的影响

结果显示IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量在模型组大鼠中较假手术组显著升高（均P＜0.01）；给予0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨莶草水煎液含量显著降低（均P＜0.01）。见表4。

表4 豨莶草对IR 大鼠脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α 和NF-κB 含量的影响（ng/L，）

2.5 豨莶草对IR 模型大鼠脑组织PI3K 和Akt 蛋白表达的影响

结果显示，模型组PI3K 和Akt 蛋白表达较假手术组显著升高（均P＜0.01）；给予0.90 g/kg 和1.35 g/kg豨莶草后表达显著降低（均P＜0.01）。见表5。

表5 豨莶草对IR 大鼠脑组织PI3K 和Akt 蛋白表达的影响（）

3 讨论

缺血再灌注损伤是脑卒中的一个主要合并症，研究显示脑缺血由两部分组成：低氧和血管反应。其中一个重要的血管反应即脑水肿，是脑缺血后导致中枢神经系统损伤，破坏血脑屏障进而产生。在脑缺血后复杂的病理损伤机制中，炎症反应、氧化应激是IR 损伤的主要原因，是目前神经科学研究的热点，抗氧化应激、减轻炎症损伤成为治疗缺血性脑血管病的主要途径之一。目前对于IR 损伤并无特效药，通过神经功能评估和病理检测可表明0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨莶草水煎液对IR 损伤具有良好的保护作用，且古籍《品汇精要》“治中风失音不语，口眼歪斜，时吐涎沫”及《本草蒙筌》“疗暴中风行邪，口眼喎斜者立效”均表明豨莶草对脑卒中具有良好的疗效，但对豨莶草抗IR损伤研究较少。因此本文基于PI3K/Akt 信号通路探讨其抗IR 损伤的作用机制。

PI3K/Akt 通路已被确定为调节细胞增殖、生长和血管生成重要参与者的主要信号通路之一，可减少炎症基因的诱导，在IR 损伤的炎症反应中起着重要的作用。近年来，针对PI3K/Akt 信号轴为靶点的药物开发也越来越受到关注，研究表明川芎嗪可通过PI3K/Akt 信号通路缓解IR 损伤；珠子参皂苷能通过调节PI3K/Akt 信号轴抑制线粒体介导的凋亡，防止脑缺血细胞凋亡；小檗碱可通过激活PI3K/Akt 信号通路减少炎症从而降低IR 损伤，这些均表明PI3K/Akt 信号轴在脑缺血中的重要作用。本研究发现0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨莶草水煎液可显著降低PI3K和Akt mRNA 的表达，同时显著降低PI3K 和Akt 蛋白的表达，表明豨莶草水煎液可能是以PI3K/Akt 信号轴为靶点的抗IR 损伤候选药物，这种作用可能是通过抗炎发挥作用的。

NF-κB 在调节机体免疫反应中具有重要作用，也是参与炎症反应最重要的蛋白质之一，其在IR 损伤的炎症反应中的作用已有报道。在本研究中观察到IR损伤后NF-κB、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量上升，但这些参与炎症的因子在0.90 g/kg 和1.35 g/kg 豨莶草水煎液组均下调，表明豨莶草水煎液具有抗炎作用，能减轻IR 损伤所致炎症反应。另外，研究表明TNFα 在炎症性疾病中发挥重要作用，可通过刺激NF-κB的产生而加重卒中大鼠的IR 损伤，并可通过增加血管通透性，增加血脑屏障的损伤，引起脑水肿。本研究中，豨莶草水煎液的神经保护作用可能是通过下调NF-κB 和TNF-α 的含量发挥抗炎作用实现。

综上所述，豨莶草水煎液抗IR 损伤可能是通过调节PI3K/Akt 信号通路抑制NF-κB、TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量得以实现的。本研究是在动物体内进行的，因此，今后有必要在临床条件下评价豨莶草对脑卒中患者的疗效。