基于JNK/AMPK-mTOR 调控Bcl-XL 对急性髓系白血病细胞化疗敏感度的干预作用

郭艳荣 金丽虹 林佩佩 段玉波

1.台州市中心医院（台州学院附属医院）血液内科，浙江台州 318000；2.浙江省台州医院小儿外科，浙江台州 317000；3.江西省肿瘤医院重症医学科，江西南昌 330000

造血系统的恶性疾病是急性髓系白血病，造血细胞增殖失控、凋亡受阻、分化障碍是其特征。在不同类型的细胞中，Jun 氨基末端激酶（JNK）可促凋亡效应、传递抗凋亡信号、激活细胞凋亡信号通路。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是一种应激反应酶，AMP/ATP 比例升高时影响细胞的生物学行为是因为AMPK 激活促进细胞内转录调节。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可调节细胞生长增殖、自噬、凋亡等生理过程，mTOR 在能量充足时激活、缺乏时抑制。最近有文献报道，B 淋巴细胞瘤XL 蛋白（Bcl-XL）表达的高低与癌细胞对化疗的敏感度密切相关。因此，本研究基于JNK/AMPK-mTOR 调控Bcl-XL 对急性髓系白血病细胞化疗敏感度的干预作用，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究细胞

白血病HL-60 细胞株由中国科学院上海生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 白血病HL-60 细胞株复苏，以完全培养液：含体积分数为0.20 的灭活胎牛血清（上海语纯生物科技有限公司）、置40℃、体积分数7% CO的培养箱培养，隔日换液，存活细胞百分率（台盼蓝拒染法）＞90%。

1.2.2 分组和转染 急性髓系白血病组（100 nmol/L+脂质体）、阴性对照组（不做任何处理）、下调Bcl-XL 组（100 nmol/L inhibitor+脂质体），按照脂质体转染的说明书将上述各组细胞进行转染，转染后继续培养6 h，更换成完全培养基，在常规条件下继续培养，待培养48 h 后收集细胞进行后续实验。

1.2.3 检测Bcl-XL 采用免疫细胞化学染色，取单层细胞片，在纯丙酮中固定25 min。放在甲醇溶液孵育20 min，除去过氧化物酶。滴加正常细胞，封闭10 min，去余液。滴加Bcl-XL 抗体，过夜。PBS 共洗5 min×10次。滴加生物素化Bcl-XL 抗体，孵育。滴加SABC 试剂，孵育。

1.2.4 细胞增殖能力 三组取HL-60 细胞，制成浓度为120 个／ml 的细胞悬液，以每孔120 μl 接种于83孔细胞板上。加入25 μl／孔MTT 试剂孵育。弃上清后，加入120 μl 二甲基亚枫震荡反应使结晶紫溶解充分。设定酶标仪检测波长为430 nm，检测各组细胞的光密度（OD）值，并记录。

1.2.5 细胞凋亡情况 以每孔5×10个细胞接种6 孔板，加完全培养液0.5 ml，洗涤；0.25%胰蛋白酶消化，离心。细胞调亡分析：加195 μl Annexin V-FITC 结合液（购自碧云天生物技术有限公司）重悬细胞，加5 μl结合液，混匀，孵育，加结合液重悬细胞。

1.2.6 MTT 检测 选择3 对Bcl-XL 进行后续研究，HL-60 细胞以2×10/孔接种96 孔板，将细胞分成3组，具体步骤严格按照说明书进行，结果得到OD 值，根据公式计算细胞增殖抑制率[抑制率（%）=（1-样品孔OD 值/空白对照孔OD 值）×100%]，然后再根据改良寇式法计算出各组药物的IC值。

1.2.7 检测采用 免疫印迹 P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K 表达。选取细胞株，离心得提取液，根据总蛋白体取试剂盒（上海尚宝生物科技有限公司）提取蛋白质浓度。取适量蛋白浓度进行SDS-PAGE 电泳分离。洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的细胞，孵育，洗膜。结果用LabWorks3.0 软件以目的条带β-actin 的灰度值进行分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组Bcl-XL 的表达

Bcl-XL 下调组Bcl-XL 表达低于急性髓系白血病组和阴性对照组，阴性对照组低于急性髓系白血病组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 各组Bcl-XL 的表达（）

2.2 各组细胞增殖能力比较

在24、48、72 h，下调Bcl-XL 组细胞吸光密度值均低于急性髓系白血病组和阴性对照组，阴性对照组低于急性髓系白血病组（均P＜0.05），其中在72 h 差异表现最为明显；阴性对照组和急性髓系白血病组随着时间延长，细胞吸光密度值逐渐升高，下调Bcl-XL组逐渐降低（均P＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞吸光密度值比较（）

2.3 各组细胞72 h 凋亡情况比较

下调Bcl-XL 组细胞胞浆减少、细胞核染色质固缩偏向一边、细胞体积明显变小，表面有凋亡细胞形态学改变，并可见细胞碎片；阴性对照组数量与急性髓系白血病组相比较少。见封三图2。

2.4 各组间急性髓系白血病细胞对Bcl-XL 的IC50值

急性髓系白血病组IC值高于阴性对照组、下调Bcl-XL 组；下调Bcl-XL 组IC值低于阴性对照组（均P＜0.05）。见表3。

表3 各组间急性髓系白血病细胞对Bcl-XL 的IC50 值（）

2.5 各组P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K 蛋白相对表达量

下调Bcl-XL 组P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K表达分别低于其他两组；阴性对照组低于急性髓系白血病组（均P＜0.05）。见表4、图1。

图1 各组细胞P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K 蛋白表达比较（W B图）

表4 各组P-JNK、AMPK、mTOR、P70S6K 蛋白相对表达量（）

3 讨论

急性髓系白血病是临床一种严重的致死性疾病，白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病，是常见的恶性血液系统疾病，主要是因细胞凋亡受抑制、分化受阻、增殖不受控制，致造血细胞停留在造血的不同阶段。化疗是目前的主要治疗方法，但不能有效延长生存期，因此诱导凋亡为白血病治疗带来新的希望。抑制正常的造血功能是因为白血病细胞在骨髓和其他造血组织的大量增殖、浸润。因此，本文旨在研究基于JNK/AMPK-mTOR 调控Bcl-XL 对急性髓系白血病细胞化疗敏感度的干预作用。

有资料显示JNK 有双向作用，既可抑制细胞凋亡，也可促进细胞凋亡，这取决于不同的细胞类型。AMPK 通过抑制mTOR 信号通路，促进细胞凋亡、抑制增殖，抑制多种恶性肿瘤的发生。Pei等研究表明AMPK 调节炎症可诱导肿瘤细胞周期停滞、代谢变化，从而抑制癌症。mTOR 在细胞分化、生长及增殖中具有重要的调节作用。

董红娟等报道Bcl-XL 基因介导白血病细胞耐药的形成。抑制细胞凋亡的能力，降低细胞凋亡的阈值通过阻止Bcl-XL 表达，恢复肿瘤细胞对化疗药物治疗的敏感度。调节凋亡蛋白的表达与急性白血病化疗效果关系通过研究Bcl-XL 的表达，急性白血病化疗效果与Bcl-XL 关系的研究也有报道，特别是对抗凋亡蛋白Bcl-2 在不同预后的急性白血病患者细胞中的表达研究较多。本研究结果显示，下调Bcl-XL后急性髓系白血病细胞凋亡数量明显增加。细胞凋亡的调节是凋亡调节因子组成和完成的，对个别凋亡调节蛋白与急性白血病化疗效果的研究不够全面。

本研究结果显示下调Bcl-XL 组IC值降低，说明下调bcl-XL 组增强急性髓系白血病细胞化疗敏感度。Bcl-XL 的低表达使多种细胞毒化疗药物耐受性对肿瘤细胞增加，促进凋亡。最近有文献报道，Bcl-XL的高低与肝癌、卵巢癌细胞、急性髓系白血病中对化疗药物的敏感度密切相关，可降低急性髓系白血病细胞化疗敏感度。

P-JNK 通过使c-jun 等63、73 位丝氨酸双磷酸化，调节AP-1 家族成员的转录活性，将信号从细胞表面传导到细胞内部。AMPK 一方面通过调节代谢恢复细胞能量，另一方面可通过抑制下游信号分子mTOR 活性抑制细胞生长、诱导细胞凋亡及增加细胞自噬水平。雌激素受体过表达可激活AMPK，抑制mTOR，进而诱导人急性髓系白血病细胞自噬，抑制细胞增殖。P70S6K 在调节细胞生长、细胞周期进程和细胞增殖中起着明显的重要作用。本文研究结果显示，下 调Bcl-XL 组增殖蛋白mTOR、P70S6K、P-JNK、AMPK 表达抑制急性髓系白血病细胞增殖。

综上所述，通过JNK/AMPK-mTOR 信号通路下调Bcl-XL，能改善急性髓系白血病细胞化疗敏感度，抑制急性髓系白血病细胞增殖，促进凋亡，为临床急性髓系白血病细胞化疗敏感度治疗提供理论依据。