圆柏大痣小蜂幼虫龄期测定

吕 东，赵 祜，赵兴鹏，赵 明，赵国生，王艺林，刘 莹，陈 敏*，王光宇*

(1. 甘肃省祁连山水源涵养林研究院,甘肃张掖 734000 ； 2.北京林业大学林木有害生物防治北京市重点实验室，北京 100083)

圆柏大痣小蜂MegastigmussabinaeXuetHe是膜翅目Hymenoptera大痣小蜂科Megastigmidae大痣小蜂属Megastigmus的寡食性害虫(徐志宏和何俊华, 1989; 李孟楼, 2002; Petretal., 2017)。幼虫以祁连圆柏SabinaprzewalskiiKom.种仁为食，并与球果的生长发育同步，其生活史大部分时间都在球果种仁内为害，具有隐蔽性且不易观察。该蜂在肃南县境内植株果实虫害率高达100%，其他地方的果实虫害率也达到90%以上，分布于整个祁连山林区，危害面积达16 567 hm2。近年来，由于圆柏大痣小蜂种群的自然扩张和人为种苗运输，在西藏自治区中部的热振国家森林公园的大果圆柏JuniperustabeticaKom.种仁内也发现圆柏大痣小蜂为害(索南措等, 2020)。关于圆柏大痣小蜂幼虫虫龄划分及测定方面的研究未见报道，明确其幼虫各发育阶段的特征，有利于准确了解圆柏大痣小蜂幼虫的发育情况并开展相应的防治措施。

Dyar(1890)通过总结27种鳞翅目幼虫龄期的研究发现，大部分鳞翅目幼虫的头宽在每次成功蜕皮后都呈有规律的几何式增长，称作Dyar氏法则，并认为骨化结构会在幼虫蜕皮的过程中有规律地增长，可作为分龄过程中的可靠指标。在一些天牛的幼虫中，非骨化指标也可被用来划分幼虫龄期，如气门长(宽)、刚毛数、体宽及体长等(黎保清等, 2012; 王小艺等, 2012; 潘龙等, 2015)。

本研究通过测定自然条件下圆柏大痣小蜂幼虫上颚关节宽、头宽、体宽和体长4项指标，并结合频次分布等方法确定幼虫的龄数及龄期，为进一步明确圆柏大痣小蜂的生物学特性及该害虫的合理防治提供理论基础，同时也为野外调查和快速判断幼虫虫龄提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

圆柏大痣小蜂的幼虫和蛹均通过解剖祁连圆柏球果获得，祁连圆柏受害果采集于甘肃省张掖市肃南裕固族自治县头滩地区的祁连圆柏林(海拔2 700 m)。采集日期自2019年6月16起至2020年5月15日结束，开始的两个半月(6月16日-8月27日)大约每半个月采集一次，其余各龄幼虫间隔约1个月，于样地采集球果至实验室解剖获得。为准确获取1龄幼虫，在圆柏大痣小蜂成虫羽化中期摘取1年生祁连圆柏球果，于实验室常温条件保存，每天解剖观察幼虫是否孵化。幼虫解剖后先置于75%酒精中浸泡麻痹后转移至0.1 M，pH 7.4 PBS缓冲液中保存待测。

1.2 幼虫形态指标的测定与龄期划分方法

幼虫各龄期测量指标均利用Leica M205 FA体视显微镜获取。测量共选择圆柏大痣小蜂幼虫的4个形态指标：上颚关节宽-Y1(上颚两侧最宽处距离)；头宽-Y2(头两侧最宽处距离)；体宽-Y3(第6体节宽)和体长-Y4(头至体末长)，如图1所示。

图1 圆柏大痣小蜂幼虫虫龄划分的4个测量指标Fig.1 Four variables measured for separating instars of Megastigmus sabinae larvae注：Y1，上颚关节宽；Y2，头宽；Y3，体宽；Y4，体长。Note: Y1, Mandible joint width; Y2, Head width; Y3, Body width; Y4, Body length.

用Origin 2018绘制圆柏大痣小蜂幼虫的各项测量指标的频次分布图，初步确认幼虫龄数。根据分龄结果计算主要指标的平均值、标准差、变异系数、Crosby指数等。当变异系数<20%、Crosby指数<10%时，分龄准确，该指标符合要求(Craig, 1975)。生长率和Crosby指数按如下公式计算(王小艺等, 2005)。最后根据Dyar氏法则，利用SPSS 23.0中的回归分析对幼虫不同指标的生长曲线进行拟合。

式中G为生长率(growth rate)，即Dyar氏指数，也称Brooks指数(Loerch and Cameron, 1983)。xn和xn-1为相邻两龄幼虫分龄指标。Cn为Crosby指数，Gn和Gn-1为相邻两龄幼虫的生长率。

获得各龄期指标的范围后，选择频数分布重叠程度最小的指标，以各龄期第一次测定的时间为各龄幼虫的龄期开始时间，作图观察幼虫不同时间上颚关节宽大小，以估算各龄幼虫的龄期(根据全年调查的圆柏大痣小蜂生活史情况，5龄幼虫以至化蛹初期的时间为准)。

2 结果与分析

2.1 圆柏大痣小蜂幼虫龄数划分

通过测量625头圆柏大痣小蜂幼虫的4项指标，并分别绘制频数分布图，结果表明：上颚关节宽、头宽和体宽3个指标的频数分布均具有明显的5个峰值，而体长指标对龄期划分不明显。其中，上颚关节宽的峰值分别在0.116、0.148、0.188、0.212和0.236 mm；头宽的峰值分别为0.250、0.350、0.460、0.580和0.710 mm；体宽的峰值分别为0.525、0.700、0.975、1.375和1.700 mm。根据Dyar氏法则初步判断圆柏大痣小蜂幼虫的龄数为5龄。

在测量的4个指标中，上颚关节宽的频次分布图出现的峰值最为明显，且5个峰的重叠度相对较小。头宽与体宽的频次分布图也出现了5个明显的峰，也可以作为龄期划分的形态指标，但这两个指标为非骨化结构，受营养条件、环境等因素的影响较大，相邻龄期重叠程度较高。对各龄幼虫的上颚关节宽、头宽和体宽进行处理的各项结果显示，这3项分龄指标在不同龄数之间的各项指标均值均具有显著差异且变异系数均小于20%，Crosby指数均小于10%，幼虫生长率在1.1～1.4之间。因此圆柏大痣小蜂幼虫被划分为5个龄期(表1)。

图2 圆柏大痣小蜂幼虫频次分布图Fig.2 Frequency distribution of Megastigmus sabinae larvae

2.2 圆柏大痣小蜂幼虫龄期

在测定结果中，上颚关节宽的频数分布重叠程度最小，因此以上颚关节宽作为估算各龄期时间的最佳标准。已知各龄幼虫上颚关节宽的范围，将每次采样时测得的幼虫上颚关节宽数据作图(图3)，以各龄期第一次采样的时间为幼虫的脱皮时间(5龄幼虫至化蛹初期为准)估算各龄期时间。1～5龄幼虫分别为30、200、30、30、15 d，共305 d，主要以2龄幼虫越冬，极少数以1龄、3龄幼虫越冬。幼虫于次年3月中旬开始发育，4月中旬发育至3龄，经2次蜕皮于6月中下旬化蛹。

图3 圆柏大痣小蜂幼虫龄期时间划分图Fig.3 Time division of Megastigmus sabinae larvae instar

3 结论与讨论

目前，划分和确定幼虫种群龄期主要通过室内个体饲养测定和自然界的种群众数龄期测定两种方法，由于幼虫的生存条件不同，两者之间所测定的幼虫龄期往往存在一定差异(戴志一, 1980)，前者主要适用于鳞翅目及部分膜翅目等食叶幼虫的龄期结构(王建伟, 2011)。由于不同科属间幼虫骨化程度较高的部位有差别，因此在测量不同幼虫中选择的指标也略有不同，如鞘翅目天牛科幼虫通常选择头壳、前胸背板、上颚等部位的指标作为分龄的依据(王小艺等, 2012; 任骥, 2014)；鳞翅目幼虫通常选择头壳、上颚、复眼间距及体长(宽)等指标(杨美红等, 2012; 陈琪等, 2015; 孙玉剑等, 2018)；膜翅目幼虫则大多选择头壳宽、上颚长(宽)、体长(宽)等指标(范丽清, 2008; 刘长月等, 2011)，另外，还可通过测定膜翅目幼虫的尾铗长(宽)来进行划分(闫家河等, 2020)。这些生长指标的测量值反映了幼虫不同阶段的生长情况，同时也能够反映出龄期划分的合理性。

李秉新等(1991)在描述圆柏大痣小蜂生活习性的时曾提到过圆柏大痣小蜂幼虫分为5龄，但并未介绍各虫龄的具体判断方法。本研究通过测量圆柏大痣小蜂幼虫上颚关节宽、头宽、体宽和体长4项指标，并计算这4项指标的均值、标准误差、变异系数、Brooks指数和Crosby指数，将幼虫划分为5龄。通过对各项分龄指标的平均值进行指数拟合，发现上颚关节宽、头宽与体宽这3项指标与龄数间的关系均符合Dyar氏法则，且均可以解释种群90%以上的个体发育情况，进一步表明圆柏大痣小蜂幼虫划分为5龄是准确的，上颚关节宽为最理想的分龄指标。在对体长的划分时发现龄期划分不明显，且重叠度较高，因此不宜用于幼虫龄数的划分。另外，由于上颚关节宽度较小，野外调查和室内研究中通过测量上颚关节宽来判断幼虫龄期较为困难，因此，可参考圆柏大痣小蜂幼虫各龄期的头宽与体宽测量范围(表1)来进行快速判断。

根据调查与分析结果估算幼虫总共历期为305 d，1～5龄幼虫的各龄时间分别为30、200、30、30、15 d。吴洪源等(1992)认为圆柏大痣小蜂主要以3龄幼虫越冬，本研究通过结合上颚关节宽对龄期的划分与调查时间来进行判断，认为圆柏大痣小蜂越冬时的虫龄主要为2龄而并非3龄。

本研究明确了圆柏大痣小蜂的幼虫龄期数和最佳分龄指标，同时获得各龄期上颚关节宽、头宽、体宽3项指标的范围值，为进一步开展该害虫的生物学生态学、防控技术等研究提供指导。