意大利蜜蜂雄蜂不同组织中BH4及其相关生物胺含量差异分析

舒蕊 刘健 赵萍 刘震 代君君

（安徽省农业科学院蚕桑研究所，合肥 230061）

生物胺是进化上保守的神经化学物质，作为一种弱碱性低分子量含氮化合物，主要由氨基酸脱羧形成或醛类、酮类氨基化形成，在无脊椎动物和脊椎动物中作为神经递质、神经激素和神经调节剂发挥作用[1]。昆虫体内生物活性胺主要有5 种，即多巴胺（dopamine,DA）、酪胺（tyramine，TA）、章鱼胺（octopamine，OA）、色胺（serotonin,5-HT）和组胺（histamine）[2]。昆虫生物胺调节广泛行为的神经回路，包括种内攻击性[3]、嗅觉敏感性和气味辨别力[4]、昼夜节律[5]、记忆形成[6]以及表现群居物种的行为状态转变[7]。其中，摄食与生殖是生物胺影响的较为重要的两个生理行为。

一是生物胺影响蜜蜂的摄食行为：在社会性群居昆虫中，劳动者的生物胺水平会随环境而变化，并与行为发育和分工有关。例如，OA对蜜蜂的摄食活动有很强的影响，工蜂大脑中OA 水平随着日龄增长以及在巢外获得的经验而增高[8]。OA的实验性升高导致幼蜂提前离开蜂巢开始觅食[9]，也改变采集蜂的资源选择[10]，并且通过舞蹈语言影响采集蜂对各类摄食场地的“获利”[11]。蜜蜂OA和TA参与了摄食行为中的食物“唤醒”过程：喙伸展反射是蜜蜂觅食行为中的一种引起食欲的刺激，它是通过用一滴糖水触碰一根触角而引起的。用药物利血平耗尽蜜蜂神经系统中的单胺类物质，30%的蜜蜂喙伸展反射消失，其余蜜蜂对该反射的反应性降低。注射OA或其代谢前体TA 可恢复无反应动物的反射，TA 也可增强有反应性动物的反射[12]。可见，TA 和 OA有促进蜜蜂摄食的作用。然而，蜜蜂大脑中5-HT 的增加会抑制进食，刺激肠道的肌肉收缩；但蜜蜂血淋巴中5-HT 的普遍升高并不影响食物的摄取[13]。

二是生物胺影响蜜蜂生殖发育及生殖行为：社会性生活的昆虫具有严格的生殖任务分担，大都只需要极少数个体承担生殖任务，有的甚至一个群体中只有一个个体承担生殖任务。一个蜂群中只有蜂王承担生殖任务。生物胺是影响昆虫生殖状态非常重要的一种微量物质。研究发现正常蜜蜂群中蜂王脑内的DA含量要比工蜂脑内的含量高；如果蜂群中缺少蜂王，一些工蜂脑中的DA含量明显升高，接着其卵巢管开始发育并能产卵，以致成为真正的生殖工蜂，说明蜜蜂脑内的DA含量变化能改变其生殖状态[14]。在黄蜂（Bombus terrestris）[15]和[16-17]、蚂蚁（Diacamma）和果蝇（Drosophila melanogaster）中，发现多巴胺和卵巢发育的关系也是如此[18-19]。在没有蜂王的蜂群中，工蜂卵巢中5-HT受体（Am5-HT7）表达上升[20]，另外，在没有蜂王的黄蜂群中，5-HT含量高的个体，卵巢更发达[16]。研究者给无蜂王的蜂群中的工蜂喂食OA或TA，发现喂食TA的蜜蜂卵巢发育增强，并产生更多的蜂王信息素，促进了工蜂向蜂王转变；并且喂食OA的工蜂产生工蜂信息素的能力增强，巩固了工蜂原有的生殖状态[21]。

总的来说，五种生物胺中，TA、DA 和5-HT 有促进昆虫卵巢发育的作用；OA 有抑制昆虫卵巢发育的作用；组胺对昆虫生殖状态影响的效果和方向目前尚不明晰。可见，不同生物胺对昆虫生殖状态影响方向不同。

三是昆虫BH4及其相关生物胺合成途径：DA、DA和5-HT的生物合成途径如图1所示：DA由酪氨酸（tyrosine）代谢而来，酪氨酸在酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）羟基化作用下形成多巴（dopa），然后多巴通过多巴脱羧酶（dopa decarboxylase,DDC）形成多巴胺，其中酪氨酸的羟化反应步骤是多巴胺合成的限速步骤[22]。TA也是以酪氨酸为底物，通过酪氨酸脱羧酶（tyrosine decarboxylase,TDC）脱羧形成的[23]。OA是在酪胺的基础上，经过酪氨酸-ß-羟化酶（tyrosine hydroxylase,TBH）羟基化形成的[24]。5-HT由色氨酸（tryptophan）衍生而来，第一步是限速步骤，是色氨酸在色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase,TPH）作用下生成5-羟色氨酸（5-hydroxy tryptophan,5-HTP），其产物再通过5-羟色氨酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase,AADC）作用生成5-HT[25]。

DA、DA 和5-HT 的合成限速步骤都需要四氢生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin,BH4）作为辅因子。BH4 是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸三种芳香族氨基酸羟化酶的辅因子[26]。BH4 缺乏会使酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）和色氨酸羟化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）活性降低，导致神经递质前质多巴（DOPA）和5-羟色氨酸（5-HTP）生成受阻，影响了脑内神经递质DA、5-HT 的生成，所以BH4是生物胺合成的限速因子[27]。如图1所示，BH4 在转化为醌类二氢生物蝶呤（Quinone dihydrobiopterin,qBH2）过程中，为这三种生物胺的合成提供了帮助。

综上所述，生物胺在蜜蜂的摄食和生殖行为中发挥着重要的作用，相关的研究报道较多的停留在这几种神经递质本身，并且研究对象集中于雌性蜜蜂，而对于影响生物胺生物合成的代谢通路鲜有关注，特别是BH4 作为形成DA、TA、5-HT 这三种生物胺必不可少的营养辅因子，蜜蜂中未见有关BH4 及其与生物胺相互作用的研究报道。

本研究选择意大利蜜蜂中的雄蜂作为研究对象，测定雄蜂四个组织中影响摄食和生殖的三种生物胺（DA、TA、5-HT）含量以及影响三者合成的BH4 含量，初步分析蜜蜂群中的雄性个体体内BH4 及其相关生物胺的水平差异，为后续更好地研究蜜蜂体内BH4与生物胺的相互作用及其功能提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验蜜蜂

选择安徽省农业科学院蚕桑研究所意蜂实验蜂场的五个蜂箱内的雄蜂共20 只，冷冻于-80 ℃冰箱内，以备后用。

1.2 蜜蜂组织处理

利用解剖刀或解剖剪将20 只雄蜂的头(去除触角)、胸、腹、足四部分组织分离，每一种组织用液氮和研钵，研磨成粉后，称取1 g，加入9 g 的pH 7.2～7.4 的PBS 缓冲液，用匀浆器将标本匀浆充分，静置10 分钟。随后在4 ℃、2000 rpm/min 条件下离心20 分钟，收集上清。每一个样品的测定样都如上所述处理，每一个样品设置3 个平行样。其余上清液冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心，去除沉淀后再使用。

1.3 测定步骤

1.3.1 测定试剂盒

昆虫四氢生物蝶呤(BH4)酶联免疫分析试剂盒、昆虫5-羟色胺(5-HT)酶联免疫分析试剂盒、昆虫多巴胺（DA）酶联免疫分析试剂盒、昆虫章鱼胺(OA)酶联免疫分析试剂盒，均购自于上海莼试生物技术有限公司。

1.3.2 操作步骤

1.3.2.1 标准品的稀释：按照表1在试管中进行稀释，获得相应的标准品溶液。

表1 标准品稀释表

1.3.2.2 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为5 倍）。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

1.3.2.3 温育：用封板膜封板后置37 ℃温育30 分钟。

1.3.2.4 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用。

1.3.2.5 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

1.3.2.6 加酶：每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。

1.3.2.7 温育：操作同1.3.2.3。

1.3.2.8 洗涤：操作同1.3.2.5。

1.3.2.9 显色：每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 分钟。

1.3.2.10 终止：每孔加终止液50 μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

1.3.2.11 测定：以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。

1.3.3 计算

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。待测物质的标准曲线依次为：BH4，y=66.72x-0.3572（R2=0.9958）；DA，y=32.431x + 0.3441（R2=0.9955）；OA，y=45.937x-0.049（R2=0.9945）；5-HT，y=50.0790x-0.6702（R2=0.9948）。

1.3.4 数据处理

根据标准曲线，计算出所测物质的含量后，运用SPSS软件进行平均值、标准差及数据间的相关性分析，再利用GraphPad Prim 8 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 意大利蜜蜂雄蜂BH4及三种生物胺的含量分析

依次测定意大利蜜蜂雄蜂的头部（Drone bee-Head，DL）、胸部（Drone bee-Thorax，DT）、腹部（Drone bee-Abdomen，DA）和足（Drone bee-Leg，DL）四种组织中BH4、DA、OA、5-HT 含量，共得到48 个数据，共计16 组数据。通过SPSS 软件先进行均值与标准差分析，得到数据表2；再对每一组数据进行显著性相关性分析，利用画图软件GraphPad Prim 8 作图得到图2。

表2 BH4及生物胺含量的平均值及标准差

由表2和图2可知，BH4、DA、OA、5-HT 在意大利蜜蜂雄蜂体内的四个组织中分布水平各有不同。BH4、DA、5-HT 三者在四种组织的含量分布趋势基本一致，都是头 ＞ 胸 ＞ 腹 ＞ 足，且大部分组间数据具有显著性差异（p＜0.05）。OA 在四种组织中的含量虽略有不同，但是不具有显著性差异（p＜0.05）。同时，四种物质都是在雄蜂的头部含量最高。

2.2 意大利蜜蜂雄蜂BH4及三种生物胺含量相关性分析

利用SPSS 软件里的相关性分析，对意大利蜜蜂雄蜂四种组织中所测得的BH4、DA、OA、5-HT 含量计算相关系数，相关系数矩阵如表3。

如表3所示，BH4与DA、5-HT显著相关（p＜0.01），与OA没有相关性（p＞0.01）。同理可知，DA、BH4、5-HT三者之间显著相关（p＜0.01），但是三者与OA 都没有相关性（p＞0.01）。这一结果与四种物质在雄蜂不同组织间的分布趋势吻合。

表3 相关系数矩阵

3 讨论

蜂群中的雄性个体的主要作用是繁衍族群，作为父本与蜂王交配，产生子代，延续蜂群。雄蜂的生殖功能就是对于蜂群最大的意义，相对地，雄蜂自身的生存技能，比如采粉寻蜜等功能被大大地削弱甚至消失。雄蜂一般都是依靠蜂群中的工蜂才能获得食物，直接被喂食或者采食蜂巢中的蜂蜜。生物胺作为能够同时影响生殖与摄食的神经递质、神经激素和神经调节剂，其在雄蜂中的分布与功能是值得关注的。

本研究选择影响蜜蜂生殖和摄食行为的最重要的三种生物胺——DA、OA 和5-HT，以及影响三者合成的辅因子——BH4，测定了这四种物质在意大利蜜蜂雄蜂四种组织间的分布水平。结果发现，雄蜂的头部（大脑）中四种物质的含量最高，这与它们的组织分布和功能是一致的，调控生殖与摄食行为的主要器官就是蜜蜂的大脑。此外，雄蜂的胸部、腹部、足中BH4、DA、OA 的分布水平依次下降，而5-HT 的含量与头部基本一致，组织间并无显著性差别。SPSS相关性分析也发现，BH4、DA、OA 三者间呈显著相关（p＜0.01），5-HT 与三者都没有相关性（p＞0.01）。由此我们发现，虽然从生理上的合成代谢通路上来看，DA、OA、5-HT 都需要BH4 作为辅因子，但是在意蜂雄蜂体内BH4 对于DA、OA 合成的影响远远大于5-HT，这可能与三者的生理功能差异有关。

DA、OA 和5-HT 在蜜蜂中发挥的功能各有差异。在生殖方面，DA 和5-HT 都有促进蜜蜂卵巢发育的作用，OA 则有抑制蜜蜂卵巢发育的作用；在摄食方面，TA 和OA 有促进蜜蜂摄食的作用，5-HT 是有抑制蜜蜂摄食的作用。可见，三者的功能是多样且复杂的，同时当前关于蜜蜂生物胺的研究较多的集中于雌性蜂上，对于雄蜂的生殖和摄食影响相关的研究较少，暂时也无法准确的判断雄蜂体内DA、OA 和5-HT 分布的具体意义，但是我们的研究明确地表明了意大利蜜蜂雄蜂体内同样存在这三种影响雄蜂生理功能的生物胺，并且蜜蜂体内的DA、OA 的合成直接受到BH4的影响，且三者的分布趋势呈现明显的相关性。