乙醇-硫酸铵双水相体系萃取苹果多酚及与血清胆红素相关性研究

安 琼 王 江 文 田 春 尧 卫 阳 飞 王 贞 香*

（1.河西学院中西医结合研究所；2.甘肃省河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃 张掖 734000；3.中科院西北高原生物研究所，青海 西宁 810000）

苹果多酚是苹果中的营养物质，主要包括羟基苯甲酸类、花色苷、黄烷醇类、二羟查耳酮以及黄烷-3-醇类等五类化合物［1］，它具有抗氧化、清除自由基、抗过敏、抗突变及抗癌、抑制高血压等作用［2-3］.

据文献报到，对苹果多酚常见的提取方法有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取等［4-5］.有机溶剂提取法提取时间较长，有机溶剂用量多［6］；超声波辅助法的虽然可缩短提取时间，但此法溶剂消耗过快，破坏程度较大［7］；超临界流体萃取法避免了使用有毒溶剂，溶剂回收简单，节约能源，但是该法，对设备要求高，一次性投资大［8］.

双水相萃取（Aqueous Two-phase Extraction，ATPE）是依据物质在两相间的选择性分配.当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键、和离子键等）存在和环境因素的影响，使其在上下相中的浓度不同［9］.其优点：萃取环境温和，易操作，不会引起生物活性物质失活或变性；传质速度快，可快速萃取目标分析物［10-14］.

在前期研究中，课题组的老师发现苹果多酚对血清胆红素有降解的作用.胆红素是由红细胞破裂后释放出的血红蛋白转化而来的一种有毒代谢产物.尤其在新生儿体内，当胆红素（大部分为未结合胆红素）在体内积聚，会引发黄疸（neonatal jaundice）.患儿的胆红素水平会持续增高，使患儿出现酸中毒、感染、缺氧等症状，重者可致中枢神经系统受损，产生胆红素脑病，引起死亡或严重的后遗症［15］.研究苹果多酚与血清胆红素的相关性，为其相互作用的机理、探寻治疗胆红素相关疾病新药奠定理论基础.

在本研究以无水乙醇-硫酸铵建立双水相体系，考察硫酸铵浓度，乙醇浓度，温度三个因素对于苹果多酚萃取率的影响，利用Box-Benhnken 设计响应面进一步优化萃取条件，获得最佳工艺条件.在最佳工艺条件提取不同浓度的苹果多酚，将其按1：1与有异常胆红素的血清（15例病人）混合，用钒酸盐氧化法，在不同时间测定总胆红素（total bilirubin，TB），结合胆红素（direct bilirubin，DB），未结合胆红素（indirect bilirubin，IB）的浓度，分析其相关性.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

没食子酸标准品：成都德斯特生物技术有限公司；无水乙醇：天津市致远化学试剂有限公司；无水碳酸钠：天津市凯信化学工业有限公司；硫酸铵：天津市凯信化学工业有限公司，以上试剂均为分析纯试剂；乙腈（色谱纯，山东禹王试剂厂）；甲醇（色谱纯，山东禹王试剂厂）.血清总胆红素、未结合胆红素测定试剂盒（浙江泰司特生物技术有限公司）.

电子分析天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；循环水式真空泵：郑州南北仪器设备有限公司；电热恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；可见分光光度计：上海仪电分析有限公司；榨汁机：佛山乾程电气科技有限公司；离心机：无锡瑞江分析仪器有限公司；KH-3000DB数控型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），十万分之一天平（上海奥豪斯Discovery 专业性分析天平），全自动生化分析仪.

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的制备

对照品溶液：精密称取没食子酸对照品适量，配置成约500μg/mL 的溶液，作为标准溶液储备液，4℃的储存备用.

1.2.2 构建无水乙醇/（NH4）2SO4双水相体系

双水相萃取利用被分离物质在体系中的选择性分配达到分离目的［16］，当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和分子间作用力的存在和环境的影响，使目标分子在上、下相进行选择性分配［17］.被分离物质在两相间的分配服从Nernst定律，即K=Ct/Cb（Ct，Cb为被分离物质在上、下相的浓度，K为分配系数）.

称取一定量的硫酸铵，乙醇，蒸馏水和一定体积的苹果粗提液于小烧杯中，加水使（NH4）2SO4溶解，搅拌至两相充分混匀，转移到10ml刻度离心管中，加水定容至刻度，2500r/min离心5min，以加速相分离过程.准确测定上、下相体积，根据与标准样品吸光度值的对照计算上下相中苹果多酚的含量，计算相应的分配系数K和上相回收率Y%.

用该方程计算双水相萃取过程中苹果多酚的分配系数K：

其中Ct（mg/ml）苹果多酚在上相的浓度，Cb（mg/ml）是苹果多酚在下相的浓度.

相比R定义为上相与下相的体积之比：

其中Vt（ml）是苹果多酚在上相的体积，Vb（ml）是苹果多酚在下相的体积.

上相回收率Y%定义为上相苹果多酚浓度和粗提物苹果多酚浓度之比：

其中Ct（mg/ml）苹果多酚在上相的浓度，Cb（mg/ml）是苹果多酚在下相的浓度；

Vt（ml）是苹果多酚在上相的体积，Vb（ml）是苹果多酚在下相的体积.

1.2.3 血清中胆红素测定

TB（钒酸盐氧化法）：样本中总胆红素在pH3.0附近，在氧化剂和反应促进剂作用下，被氧化成胆绿素，与此同时，胆红素特有的黄色消失，测定反应前后吸光度的差，即可计算出样本中总胆红素的浓度.样本中总胆红素的含量（umol/L）=ΔAu/ΔAcXCc，其中ΔAu：测定样本中吸光度差，ΔAc：校准品吸光度差，Cc：校准品标示值.

DB（钒酸盐氧化法）：样本中直接胆红素在pH3.0附近，在氧化剂和表面活性剂作用下，被氧化成胆绿素，与此同时，胆红素特有的黄色消失，测定反应前后吸光度的差，即可计算出样本中直接胆红素的浓度.样本中直接胆红素的含量（umol/L）=ΔAu/ΔAcXCc，其中ΔAu：测定样本中吸光度差，ΔAc：校准品吸光度差，Cc：校准品标示值.

IB：总胆红素的浓度-结合胆红素的浓度

1.2.4 数据分析

用Excel 绘图，用Design-Expert8.05 进行响应面分析.采用SPSS 20.0 软件对实验数据进行统计分析.获得的实验数据以x±s表示，将不同时间点的血清浓度，采用Pearson相关性分析法考察两者的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

采用Folin-Ciocalteu（F-C）比色法测定苹果多酚的含量［8］.移取0.2g/ml 的没食子酸标准溶液1.25ml、2.5ml、3.75ml、5ml分别置于25ml比色管中，并设置一个空白对照组，加蒸馏水至刻度线.分别取1ml上述不同浓度的没食子酸溶液，向其中加入2ml F-C试剂，5min后，再加入2ml 7.5%碳酸钠溶液，将其摇匀，避光静置1h，在749nm处测吸光值，绘制标准曲线，吸光度A对浓度C的曲线方程：y=0.04478x+0.1334，R2=0.9998，线性良好.

2.2 单因素试验

2.2.1 硫酸铵用量对双水相体系的影响

固定无水乙醇3ml，蒸馏水3ml，苹果多酚粗提液2ml，分别加入1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g的硫酸铵，在离心机中离心5min（2500r），分相后，读取上下相体积，测定苹果多酚在上，下相的吸光度，求出苹果多酚的分配系数，相比，回收率，结果如图1.

由图1可以看出硫酸铵的加入量从1.0g增加到3.0g，苹果多酚的提取率不断增加，加入量大于3.0g，苹果多酚的提取率开始下降.随双水相体系中硫酸铵质量分数增加，苹果多酚的分配系数和萃取率先增大后减小，当硫酸铵用量达到3.0g时，其分配系数为9.47，萃取率为91.63%，均达到最高值.一方面是由于硫酸铵浓度增加，与乙醇争夺水，水分子由上相转移至下相，上相乙醇浓度增大，根据相似相溶，苹果多酚更易溶解在上相，使分配系数和萃取率增大；另一方面硫酸铵用量增加了乙醇与酚类物质之间氢键萃合物的生成，提高了分配系数和上相萃取率.但是当加入的硫酸铵太多时，过多的无机盐影响体系整体的萃取能力，并且硫酸铵太多，达到它的饱和溶液浓度，会有晶体析出，浪费试剂.因此，在综合考虑提取效果和绿色环保这两方面因素，选择硫酸铵用量为3.0g.

图1 硫酸铵用量对苹果多酚回收率的影响Fig.1 The influence of ammonium sulfate dosage of apple polyphenol recovery

2.2.2 乙醇浓度对双水相体系的影响

固定硫酸铵3.0g，蒸馏水3ml，苹果多酚粗提液2ml，分别加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇以及无水乙醇3ml，在离心机中离心5min（2500r），分相后，读取上下相的体积，测定苹果多酚在上，下相的吸光度，求出苹果多酚的分配系数，相比，回收率，结果如图2.

图2 乙醇浓度对苹果多酚回收率的影响Fig.2 The influence of ethanol concentration of apple polyphenol recovery

由图2 可知，随着乙醇浓度的增加，苹果多酚的分配系数和萃取率先增大后减小.在乙醇浓度为60%～70%之间上升趋势尤为明显，当乙醇浓度为70%时，苹果多酚的提取率达到最高，其原因是当体系中乙醇浓度增加使体系中更多的水分趋于上相，导致相比R增大.随着乙醇浓度继续增加苹果多酚提取率明显下降.其原因一方面可能是由于溶剂与多酚极性差异增大，根据相似相溶原理，多酚得不到充分溶解，提取率反而减少；另一方面，可能是随乙醇浓度的增加，当超过70%之后，高浓度乙醇使天然产物发生变性，使苹果多酚的萃取率反而下降.因此，苹果多酚提取的最适乙醇浓度为70%.

2.2.3 温度对双水相体系的影响

固定硫酸铵3.0g，70%无水乙醇3ml，蒸馏水3ml，苹果粗提液2.0ml，分别设置温度为20、30、40、50、60℃，在离心机中离心5min（2500r），分相后，读取上下相的体积，测定苹果多酚在上下相的吸光度，求出苹果多酚的分配系数，相比，回收率，结果如图3.

由图3可以看出，温度在30℃～50℃之间变化趋势很明显，在30℃～40℃之间陡峭上升，萃取温度为40℃时，苹果多酚的提取率达到最高值为92.92%.这是因为温度主要通过影响硫酸铵溶解度，从而影响苹果多酚在上、下相的分配.随着温度的增加，硫酸铵溶解度增加，更有利于上下相分相.当温度超过40℃时，多酚提取率减小了，因为温度过高，多酚氧化、聚合等原因导致多酚提取率降低.因此，苹果多酚提取的最佳温度为40℃.

图3 温度对苹果多酚回收率的影响Fig.3 The influence of temperature on the apple polyphenols recovery

2.3 响应曲面分析法优化工艺条件

2.3.1 Box-Benhnken实验设计（BBD）方案的确定

综合单因素实验结果，选择硫酸铵用量（A）、乙醇浓度（B）以及萃取温度（C）三个因素所确定的水平范围，使用Design-Expert8.0.6 软件设计响应面实验，选择Box-Behnken 试验设计，以多酚的提取率为响应值，进行三因素三水平共17个试验点的响应面分析试验.实验结果见表1

表1 设计方案及结果Table 1 Design scheme and results

2.3.2 回归模型的建立与显著性检查

利用Design-Eepert软件对表1试验数据进行二次多项式逐步回归拟合，建立二次多元回归方程，对该方程的回归分析与方差分析结果见各因素经多元回归拟，得到回归方程=-225.66500+89.97875A+4.93963B+0.72900B-0.28075AB-0.017000BC+0.015400BC-11.58625A2-0.032413B2-0.024587C2，对此模型的回归方程方差分析见表2.

表2 回归模型的方差分析Table 2 Variance Analysis of regression Modle

响应面模型分析结果中显示：该模型的F值为306.21，p＜0.0001，说明获得的回归方程极显著，即该模型在整个的回归区域内拟合的很好；模型的多元相关系数模型的多元相关系数R2＝0.9975，说明模型的相关性较好，预测模型拟合程度高，能很好地预测实际的处理效果；模型校正决定系数RAdj2＝0.9942，说明该模型可以解释84.6%的响应值变化，实验误差小，数据合理.

由表2可知，此模型是极显著的（P＜0.0001），不同处理间的差异高度显著.模型失拟项不显著，模型的决定系数R2=0.9975，说明模型响应值变化的99.75%来源于所选变量，实验误差较小，该模型是合适的.此模型与实验数据拟合程度和可信度较高，因此可以用此分析和预测苹果多酚得率的变化.回归方程方差分析中各变量的P值表明：一次项B，C，二次项A2，B2，C2和交互项AB，对响应值（Y）的影响极显著（P＜0.01），其中，一次项B、C，二次项A2、B2、C2以及交互相AB的p值均小于0.0001.说明B、C对响应值的线性效应极显著，AB对响应值的交互影响极显著，A2、B2、C2对响应值的曲面效应极显著.交互项BC的p值是0.0007（p＜0.01），说明BC对响应值的交互影响显著.A对响应值的线性效应不显著，AC对响应值的交互影响不显著.

2.3.3 响应面分析

为了进一步考察3个试验因子：硫酸铵用量（A）、乙醇浓度（B）及提取时间（C）的交互作用以及确定最优点，对回归模型采用降维法分析，即可得到两因子的回归模型，并通过Design-Expert 软件绘制出响应面曲线图来进行直观的分析.直观地反应出两变量交互作用的显著程度.极值条件出现在等高线的圆心处，等高线图最圆，说明它们之间相互作用对苹果中多酚的提取率的影响最大；而等高线图越扁平，表示因素之间的相互影响越小.图4-6显示了以苹果多酚提取率为响应值的趋势图.

图4 显示硫酸铵用量与乙醇浓度对苹果多酚提取率的交互作用，随着硫酸铵用量和乙醇浓度的增大，提取率逐渐升高，当达到最适条件后，再增加硫酸铵用量和升高温度，提取率下降；图5显示硫酸铵用量和温度对苹果多酚提取率的交互作用，随着硫酸铵用量的增加和温度的上升，苹果多酚提取率逐渐上升，最后趋于稳定，达到较高点后又缓慢下降；图6显示温度和乙醇浓度对苹果多酚提取率的交互作用，随着乙醇浓度和温度的升高，苹果中多酚的含量增加，最后趋于稳定.综合以上情况可以得出，硫酸铵用量与乙醇浓度、温度之间交互作用较显著，乙醇浓度与温度之间交互作用不显著.

图4 硫酸铵用量和乙醇浓度对苹果多酚提取率的交互作用Fig.4 Ammonium sulfate dosage and concentration of ethanol for apple polyphenols extraction yield of interaction

图5 硫酸铵用量和温度对苹果多酚提取率的交互作用Fig.5 Ammonium sulfate dosage and temperature on the apple polyphenol extraction yield of interaction

图6 乙醇浓度和温度对苹果多酚提取率的交互作用Fig.6 The ethanol concentration and temperature on the apple polyphenols extraction yield of interaction

通过Design-Expert 软件分析，建立了一个以苹果多酚提取率为目标值，以硫酸铵用量、乙醇浓度、温度为因子的数学模型. 通过对回归方程的优计算，得出最优提取工艺条件为：硫酸铵用量为3.07g，乙醇浓度为73.61%，温度为40℃.考虑到实际操作的影响，将各因子进行修正：硫酸铵用量为3.1g，乙醇浓度为70%，萃取温度为40℃.

2.4 苹果多酚对血清胆红素的影响

2.4.1 同一浓度苹果多酚对血清胆红素的影响

在最佳优化工艺条件下，分别萃取40g/2ml、60g/2ml、80g/2ml、100g/2ml中的苹果多酚，选取异常血清胆红素按1：1混合，在同一时间测定血清胆红素的浓度，与初始浓度相比，在80g/2ml萃取的苹果多酚对血清胆红素的影响比较明显结果见图7.

图7 不同浓度苹果多酚在同一时间对血清胆红素的影响Fig.7 Different concentrations of apple polyphenols on at the same time the influence of serum bilirubin

以80g/2ml 中萃取苹果多酚样品，选取异常血清胆红15例，然后按1：1与异常胆红的血清样本混合，体外37℃孵化，分别在0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，根据钒酸盐氧化法，用全自动生化分析仪分别测定总胆红素、结合胆红素的浓度，计算未结合胆红素的浓度.取其平均值，以时间为横坐标，以浓度为纵坐标.结果如图8、9、10所示：同一浓度的苹果多酚可使未结合胆红素、总胆红素的浓度下降，结合胆红素的影响不明显.Pearson相关性分析结果显示，未结合胆红素、总胆红素浓度呈正相关（r分别为为0.994～0.996，0.610～0.993，P均小于0.05），结合胆红素浓度无明显的相关性（r为0.335～0.662，P＞0.05），结果见表3.

表3 不同时间三种血清胆红素浓度（x±s，μmol/L，n＝15）及相关性分析结果Table 3 Three kinds of serum bilirubin concentrations and related parameters at different time points

图8 同一浓度苹果多酚对未结合胆红素的影响Fig.8 The same concentration of apple polyphenols have not combined with the effect of bilirubin

图9 同一浓度苹果多酚对结合胆红素的影响Fig.9 The same concentration of apple polyphenols have combined with the effect of bilirubin

图10 同一浓度苹果多酚对总胆红素的影响Fig.10 The same concentration of apple polyphenol effects on total bilirubin

3 结论

在单因素实验基础上，采用Box-Behnken试验设计及响应面分析，建立了萃取苹果多酚的乙醇-硫酸铵双水相体系，最佳萃取条件为：硫酸铵3.1g，乙醇浓度为70%，萃取温度为40℃，该方法绿色、易操作、萃取率高.苹果多酚可使血清中总胆红素和未结合胆红素的浓度下降，为进一步研究苹果多酚与其机制及探寻新药奠定理论基础.