植物乳杆菌LBS8强化发酵腌制白萝卜的条件优化研究

边名鸿，邹玉锋，袁乐梅，许强，唐雪梅

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000)

白萝卜为十字花科植物，含有粗纤维、芥子油和淀粉酶等有益物质，能助消化、止咳化痰，为食疗佳品。腌制白萝卜是我国传统的发酵食品，深受人们喜爱。在传统腌制过程中，因盐含量高、技术不完善、产品质量不稳定等问题限制了腌制白萝卜产业的发展[1]。

研究表明，以植物乳杆菌为发酵剂，强化发酵蔬菜能有效提高产品品质[2-3]。植物乳杆菌为同型发酵乳酸菌，能大量产酸，维持原料的pH，并且在发酵过程中能产生特有的乳酸杆菌素，起到维持肠道的菌群平衡、抑制腐败菌和调节心血管等作用[4-6]。高世阳[7]利用植物乳杆菌接种榨菜发酵，接种发酵榨菜的各项指标优于自然发酵产品；汪立平等[8]将植物乳杆菌应用于低盐萝卜泡菜，比较了不同植物乳杆菌接种发酵与传统发酵萝卜的差异，结果证明接种植物乳杆菌能缩短泡菜发酵时间；朱珺等[9]从四川泡菜中筛选出一株具有益生特性的植物乳杆菌，研究表明其对胡萝卜的口感有一定的改善作用并能显著提高发酵中的活菌数；陈延等[10]将筛选出的功能乳酸菌进行复配发酵萧山萝卜干，发现接种乳酸菌能降低产品的pH和亚硝酸盐含量，同时增加氨基酸态氮的含量等。然而，榨菜的感官特性不仅取决于原料，还取决于强化发酵剂的选择，并对其发酵条件进行优化。强化发酵剂是腌制白萝卜品质的一个重要影响因素，但很少有研究去探索强化发酵剂对腌制白萝卜的影响。

本试验将植物乳杆菌LBS8应用于白萝卜强化发酵，比较接种乳酸杆菌LBS8和传统发酵产品的差异。同时，通过监测发酵过程中总酸、乳酸菌数和氨基酸态氮含量的变化以及腌制成品的感官与理化分析，考察不同含盐量、温度、接种量和含水量对腌制白萝卜品质的影响，优化发酵白萝卜的发酵条件，以期为榨菜强化发酵剂的开发提供参考依据，同时为生产过程中的规范化、安全化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料与试剂

韩国白萝卜、白菜：市售；植物乳杆菌LBS8：实验室保藏；MRS培养基：北京陆桥技术股份有限公司；氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、甲醛、葡萄糖、酚酞、硫酸铜、亚甲蓝、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、盐酸、硼酸钠、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、冰乙酸：均购自合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

磁力搅拌器 艾测科技有限公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅 致微仪器有限公司；质构仪 英国Stable Micro System公司；冷冻干燥机 新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物乳杆菌种子液的制备

将植物乳杆菌接种于菜汁培养基，37 ℃恒温培养，转接3次，再以4000 r/min的速率离心处理15 min，用无菌生理盐水清洗沉淀物，反复3次，制成菌浓度为1.0×109CFU/mL的发酵液。

1.2.2 白萝卜腌制流程

1.2.2.1 传统腌制白萝卜工艺[11-13]

选料→剥菜→清洗→切块→脱水(含水量30%)→加盐(12%)→入坛发酵→封坛后熟→成品。

1.2.2.2 乳酸菌接种腌制白萝卜发酵工艺

选料→剥菜→清洗→切块→热风烘脱水→加盐腌制12 h→接菌(层层喷洒)→入坛发酵→封坛后熟→成品。

1.2.3 腌制白萝卜发酵的单因素试验

试验选择含盐量、发酵温度、接种量和含水量对腌制白萝卜质量进行研究,单因素试验因素水平设计见表1。基础发酵条件：白萝卜脱水至含水量为50%，用6%的盐腌制白萝卜12 h，接入6‰的植物乳杆菌发酵液，20 ℃培养20 d。当改变其中一个因素变量时，其他因素水平保持不变。

1.2.4 腌制白萝卜工艺正交优化

根据单因素试验结果可知，腌制白萝卜受含盐量(A)、发酵温度(B)、接种量(C)和含水量(D)的影响均较大，选择这4个因素进行四因素三水平的正交试验，以感官评分、硬度、酸度、乳酸菌素、氨基酸态氮含量为评定指标，以腌制白萝卜的综合评分确定出最佳的低盐腌制白萝卜工艺[14-16]，正交试验因素水平设计见表2。

表2 正交试验因素水平设计表Table 2 Factors and leves of orthogonal experiment design

1.2.5 相关参数的分析方法

1.2.5.1 酸度

按照国标GB/T 12456—2008测定腌制白萝卜的酸度，以乳酸计。

1.2.5.2 乳酸菌数

取25 g腌制白萝卜，加入225 mL无菌生理盐水，振荡30 min后进行梯度稀释，选择2～3个适宜的稀释样液，涂布于2个无菌MRS平板上，于37 ℃恒温培养2 d后进行菌落计数。

1.2.5.3 氨基酸态氮

按照国标GB 5009.235—2016中的酸度计法对腌制白萝卜中的氨基酸态氮含量进行测定。

1.2.5.4 含水量

按照国标GB 5009.3—2016中的直接干燥法对白萝卜的水分含量进行测定。

1.2.5.5 感官评定

采用百分制对腌制白萝卜的色泽、香气、质地、滋味这4大类12小类进行综合评价，感官评定标准见表3。

表3 腌制白萝卜感官品评标准Table 3 Sensory evaluation standards for pickled white radish

1.2.5.6 硬度测定

样品处理为1 cm3的正方体。选用P/2探头，图像最高点的数值为腌制白萝卜的硬度。测前速度2 mm/s，测中速度1 mm/s，测后速度1 mm/s，压缩比例为70%，每个样品测定3次，取平均值。

1.2.5.7 综合评分计算

将试验的5个指标——总酸、乳酸菌数、氨基酸态氮含量、感官评分和硬度参照黄珊[17]的评价方法，运用隶属度的综合评分法，对其进行综合评分。

1.2.5.8 抗氧化指标测定

参照Aurelia M P等[18]和Li M等[19]的研究方法，并稍作修改测定还原能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力。

1.2.6 数据分析方法

数据以平均数±标准差的形式表示。得到的数据使用SPSS进行ANOVA方差分析和邓肯多重数据分析，在P<0.05(n=3)的条件下进行差异显著性分析。利用Origin作图，不同的英文字母表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 含盐量对腌制白萝卜的影响

图1 不同含盐量对腌制白萝卜的影响Fig.1 Effect of different salt content on pickled white radish

图2 不同含盐量腌制白萝卜硬度的影响Fig.2 Effect of different salt content on hardness of pickled white radish

含盐量是腌制食品中的一个重要影响因素[20]。由图1可知，随着含盐量的增加，腌制白萝卜的酸度和乳酸菌数随之降低。乳酸菌可以抑制腐败菌的滋生，赋予腌菜独特的风味和提升腌菜的营养价值[21-22]。2%、4%和6%加盐量产品的酸度和乳酸菌数差异较小，酸度在3.69～3.91 g/kg之间，乳酸菌数在8.86～10.7 log CFU/mL之间，且显著大于传统腌制产品。氨基酸态氮也随着含盐量的增加而减小，当含盐量为6%时，感官评分最高，氨基酸态氮含量为0.048 g/100 g，超过6%时，下降速率增加，可能是由于盐度过高导致腌制白萝卜中的氨基酸态氮因渗透作用流出，被微生物利用。含盐量为6%时，腌制白萝卜的感官评分最高，硬度也高于传统产品。

2.2 发酵温度对腌制白萝卜的影响

由图3可知，腌制白萝卜的酸度和乳酸菌数随着温度的上升而增加，当发酵温度超过15 ℃时，酸度增加较快，之后趋于平缓,维持在3.69～4.13 g/kg之间。乳酸菌数在20 ℃之后变化不大，维持在8.86～8.94 log CFU/mL之间。氨基酸态氮随着发酵温度的增加而增加，之后有所下降，原因可能是白萝卜中的蛋白质被微生物分泌的蛋白酶降解为氨基酸等物质，因渗透作用流出而被微生物利用[23-24]。腌制白萝卜的硬度随着温度的上升而增加，当温度在25 ℃时，腌制白萝卜的硬度达到了较高的水平，由于果胶甲酯酶的活性逐渐上升，果胶甲酯酶可将蔬菜中的高甲氧基果胶(HM)转化成低甲氧基果胶(LM)，使 LM与钙离子发生交联作用，产生一种坚固的果胶酸钙网络来保持蔬菜的脆度[25]。腌制白萝卜在发酵温度为20 ℃时的感官评分最高，但与25 ℃温度发酵的产品相差较小，分别为93.3分和91.3分，且25 ℃的腌制白萝卜硬度较高。综合考虑，以25 ℃为最佳发酵温度。

图3 不同发酵温度对腌制白萝卜的影响Fig.3 Effect of different fermentation temperatures on pickled white radish

图4 不同发酵温度对腌制白萝卜硬度的影响Fig.4 Effect of different fermentation temperatures on hardness of pickled white radish

2.3 接种量对腌制白萝卜的影响

图5 不同接种量对腌制白萝卜的影响Fig.5 Effect of different inoculation amount on pickled white radish

图6 不同接种量对腌制白萝卜硬度的影响Fig.6 Effect of different inoculation amount on hardness of pickled radish

由图5可知，腌制白萝卜的酸度和乳酸菌数随着接种量的增加而增加，当接种量超过8‰时，酸度及乳酸菌数趋于平缓，但氨基酸态氮却在上升，游离的氨基酸态氮增多，发酵产品的风味和营养价值随之增高。接种量为6‰时感官评分最高，为93.3分，但相较于10‰接种量的感官评分差异较小，为91.9分。此外，接种量超过4‰时，菜皮和菜心的硬度下降，原因可能是酸度过高，导致其生成的果胶酸减少，相应生成的果胶酸钙降低[26],但发酵产品菜心的硬度都高于传统产品。因此，植物乳杆菌强化白萝卜发酵，有利于腌制白萝卜硬度的保持。综合考虑，以10‰为最佳接种量。

2.4 含水量对腌制白萝卜的影响

图7 不同含水量对腌制白萝卜影响Fig.7 Effect of different water content on pickled white radish

图8 不同含水量的腌制白萝卜硬度的影响Fig.8 Effect of different water content on hardness of pickled white radish

由图7可知，随着含水量的增加，腌制白萝卜的酸度和乳酸菌数随之增加。当含水量超过50%时，腌制白萝卜的酸度和乳酸菌数趋于平稳，分别维持在3.69～3.96 g/kg和8.86～8.96 log CFU/mL之间。当含水量小于50%时，腌制白萝卜的感官评分随着含水量的增加而增加，但超过50%后，感官评分下降。随着含水量的增加，氨基酸态氮含量也在增加，且当含水量超过50%后，其含量增加明显。原因可能是白萝卜在脱水过程中产生应激反应，与丙氨酸、脯氨酸、GABA和谷氨酸代谢相关的酶活性在脱水过程中保持其活性，在制备过程中积累了丙氨酸、脯氨酸和GABA等氨基酸，且具有良好的口感和保健作用[27]。综合考虑，以含水量50%为最佳含水量。

2.5 腌制白萝卜工艺的正交试验优化结果

分别对4个因素：含盐量(A)、发酵温度(B)、接种量(C)和含水量(D)进行单因素试验的基础上，进一步探讨各因素对腌制白萝卜的协同影响，以腌制白萝卜产品的综合评分为指标，优化腌制白萝卜工艺。试验各指标数据见表4～表6。

表4 正交试验优化结果Table 4 Results of orthogonal experiment optimization

表5 各指标下的正交试验数据表Table 5 Orthogonal experiment data under each index

表6 各指标下正交试验的隶属度和综合评分表Table 6 Membership degree and comprehensive scores of orthogonal experiment under each index

由表4中的极差R值可知，影响综合评分的因素为A>C>D>B，即含盐量>接种量>含水量>发酵温度；其最佳工艺条件为A2B3C1D1，即含盐量6%，发酵温度27 ℃，接种量9‰，含水量45%。

2.6 传统与强化发酵白萝卜质量评价对比分析

表7 不同发酵方式腌制白萝卜的评价指标值Table 7 Evaluation index values of pickled white radish by different fermentation methods

由表7可知，最佳工艺条件下腌制白萝卜的酸度、乳酸菌数、氨基酸态氮、感官评分、菜皮和菜心硬度显著高于传统自然发酵产品，亚硝酸盐含量低于传统自然发酵产品。最佳工艺产品的还原能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力均显著高于传统自然发酵产品。本试验最佳工艺产品的抗氧化性与武晋海等的无预腌渍产品的抗氧化性相同[28]。在此发酵工艺下，腌制白萝卜酸度适中，硬度较好，有腌制白萝卜特有的琥珀色和香味，综合品质较好。初步说明功能菌LBS8强化发酵在保证腌制白萝卜感官品质的前提下，具有一定的降解产品中亚硝酸盐和提高产品抗氧化能力的作用。

3 结论

综上所述，以植物乳杆菌LBS8强化发酵腌制白萝卜对其品质影响较大，通过接种强化发酵剂发酵白萝卜较自然发酵能有效提升其产品质量，不论是硬度还是感官评分都显著提升。研究发现，含盐量、发酵温度、接种量和含水量对腌制白萝卜的品质均有影响，并通过单因素试验及正交试验，得出植物乳杆菌LBS8强化发酵白萝卜的最佳发酵条件为：含盐量6%，发酵温度27 ℃，接种量9‰，含水量45%。在该条件下发酵的腌制白萝卜酸度适中，硬度较好，有腌制白萝卜特有的琥珀色和香味，综合品质较好。酸度、乳酸菌数、氨基酸态氮含量、感官评分、菜皮硬度、菜心硬度显著高于传统自然发酵产品；亚硝酸盐含量为0.20 mg/kg，显著低于传统自然发酵产品；还原能力为119.28 μmol/L，羟自由基清除能力为39.46%，超氧阴离子自由基清除能力为78.74%，DPPH自由基清除能力为40.12%，均显著高于传统自然发酵产品。本研究为微生物强化发酵腌制蔬菜食品提供了一定的数据参考，为提高传统腌制蔬菜食品的稳定性及工业化、标准化生产提供了一定思路。