艾灸对三阴性乳腺癌移植瘤小鼠生存期的影响及机制研究

陈 军，孙 嫘，惠建荣，KHARSANOV Shakir(哈萨克斯坦)，胡 蓉，李 静

(1.陕西中医药大学针灸推拿学院，陕西 咸阳 712046；2.解放军总医院第六医学中心中医学部，北京 100048)

2020年全球新发癌症1929万例，其中乳腺癌居全球发病首位[1]。尤其是三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)对放、化疗极易产生耐受，因此，如何延长带瘤患者生存时间，提高其生活质量成为目前亟需解决的公共卫生问题[2]。有研究表明，电针可促进细胞间通信介质外泌体的分泌，有效改善脑卒中的临床症状[3]；穴位局部外泌体可能参与了针刺穴位效应启动过程[4]。针刺与艾灸的物质基础均是经络系统，通过对穴位的物理刺激而起效。本团队在前期临床研究中发现，艾灸可有效缓解晚期肿瘤患者癌因性疲乏[5]，并从艾灸与能量代谢的角度进行了初步实验，证明艾灸可有效降低低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达，现进一步探究艾灸干预三阴性乳腺癌荷瘤小鼠机制与外泌体的关系，为探寻TNBC的中西医综合治疗提供新的思路和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与细胞株：SPF级BALB/c雌性野生小鼠，体重25～30 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006；饲养于26～27 ℃和光照、黑暗交替各12 h的环境中；Luci-MB-231细胞株购自于军事医学科学院细胞中心。

1.1.2 主要实验仪器与试剂：透射电镜(型号H7650，日本Hitachi公司)；纳米颗粒跟踪分析仪(型号ZetaView，德国Particle Metrix公司)；全自动蛋白印迹仪(型号Profiblot48，奥地利帝肯公司)。抗小鼠CD63单克隆抗体、抗小鼠TSG101单克隆抗体及HRP标记二抗(美国Sigma公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)(美国博士德公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模与分组：将Luci-MB-231细胞株从液氮中取出，常规复苏并传代至3～4代，调整细胞浓度至1×107个/ml予以皮下移植。小鼠常规麻醉，仰卧位固定，于一侧上肢腋窝下缓慢推入Luci-MB-231细胞，接种2周后，选取荷瘤成功的小鼠30只，随机分为对照组及实验组各15只。

1.2.2 干预方法：实验组采用艾灸干预，参考《实验针灸学》选取关元、气海、中脘穴。每日抓取小鼠放入固定器固定，裸鼠仰卧固定，定穴后局部剪毛，用隔热纸包裹局部，隔热纸上剪5 mm×5 mm的小孔并对准穴位，将艾条固定于自制艾条架上，使艾条点燃部位垂直距离裸鼠穴位约5 mm，点燃施灸，每日每穴灸20 min，连续艾灸直至全部小鼠自然死亡。对照组小鼠仅进行抓取固定操作。

1.2.3 荷瘤小鼠生存曲线：造模成功后，每天观察、记录两组小鼠生存情况，直至全部小鼠自然死亡，采用GraphPad Prism 9软件绘制小鼠生存曲线。

1.2.4 血清收集及外泌体提取：当其中一组仅存活2只小鼠时，以此为时间节点，分别随机收集两组小鼠血样各1份，采用断头采血方法，取血1～1.5 ml。将血样置于冰盒中，4 ℃静置4～5 h，析出血清；收集血清样本以PBS稀释，4 ℃、12000 r/min离心20 min，吸取上清、PBS重悬、低温高速离心，再弃上清获得外泌体沉淀，于-80 ℃保存。

1.2.5 外泌体鉴定：利用透射电镜、纳米粒子示踪技术、蛋白印迹分析技术鉴定外泌体。①透射电镜观察：将外泌体溶液用2.5%戊二醛固定，取10 μl外泌体溶液滴加在铜网上，2 min后用滤纸吸干，加10 μl浓度为2%的磷钨酸溶液，1 min后用滤纸吸干，将铜网置于红外灯下烤干，上机观察并拍照[6]。②纳米颗粒跟踪分析仪分析：含外泌体血清样本经过滤后以磷酸盐缓冲液稀释，缓慢注入纳米颗粒跟踪分析仪，分析粒径分布及浓度。③蛋白印迹法检测表面标志物：样本冰上孵育5 min，加入200 μl含蛋白酶抑制剂的裂解液冰上裂解15 min，以14000 r/min低温离心15 min，再以BSA标准品及样品进行比对分析。根据BSA蛋白定量结果，调整8个样本蛋白质浓度，行SDS-PAGE电泳，进行转膜、封闭；以一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后以HRP标记的二抗室温孵育2 h，洗膜、ECL显影、定影。④检测两组小鼠血清外泌体浓度。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 20.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，两组组间比较采用t检验；生存曲线以Kaplan-Meier曲线呈现；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 造模成功小鼠形态学观察 接种后2周观察小鼠，造模成功小鼠腋窝处可见大于50 mm3的皮下包块(图1)。

图1 造模成功的小鼠外观

2.2 两组小鼠生存曲线 对照组第1只小鼠死亡时间是第19天，实验组第1只小鼠死亡时间是第22天，两组在第4、5周出现最高峰，对照组最长存活时间为48 d，实验组最长存活时间为53 d。两组小鼠存活率比较差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图2 两组小鼠生存曲线

2.3 两组小鼠血清外泌体形态学观察 透射电子显微镜下可见小鼠血清中有圆形或椭圆形结构，符合外泌体的形态特征。

图3 两组小鼠透射电子显微镜下外泌体形态

2.4 两组小鼠血清外泌体粒径鉴定 见图4。对照组血清外泌体平均粒径为76.70 nm，30～150 nm的囊泡占总囊泡数的99.80%；实验组血清外泌体平均粒径为78.71 nm，30～150 nm的囊泡占总囊泡数的99.34%，两组均符合外泌体粒径大小标准。

图4 两组小鼠血清外泌体粒径检测结果

2.5 两组小鼠血清外泌体表面标记蛋白检测 通过蛋白印迹法检测外泌体表面标记蛋白CD63、TSG101水平，CD63、TSG101在两组小鼠血清提取物质中均有表达(图5)。通过形态学、粒径、表面标记蛋白鉴定，可以确定提取物质是外泌体。

图5 两组小鼠血清外泌体标记蛋白CD63、

2.6 两组小鼠血清外泌体浓度比较 对照组血清外泌体浓度为(2.34×109)个/ml，实验组血清外泌体浓度为(6.19×109)个/ml，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)(图6)。实验证明艾灸延长三阴性乳腺癌荷瘤小鼠生存期的机制与促进相关细胞释放外泌体有关。

图6 两组小鼠血清外泌体浓度比较

3 讨 论

21世纪以来，随着自然科学的飞速发展，医学研究进入到现代医学阶段。针灸机制研究从“黑箱理论”“点到点”发展到“点到系统”，但终究属于“干预与效应”的线性研究模式范畴，即通过检测特异性指标，进而推导针灸的作用机制[7]。针灸的理论基础是经络，经络“内属于脏腑，外络于肢节”，从经络系统的组成及其分布预测，针灸的作用机制应该是网状、多层面、多靶点的。现代医学认为，人体各部分在相互作用中形成相互关联的整体，这与中医的整体观完全吻合。2021年诺贝尔生理学或医学奖获得者David Julius和Ardem Patapoutian两位科学家分别发现了温度感受器TRPV1和触觉感受器Piezo，揭示了热、冷和机械力引发神经冲动的机制[8-9]，而针灸疗法正是通过触觉(针)和温度(灸)对皮肤产生刺激发挥疗效。这不仅佐证了针灸的科学性，也为针灸作用机制的研究打开新的领域。

经络实质的核心问题是确定经穴与脏腑的联系途径[10]。王欣[11]提出经络的实质是“人体定向水环境调控体系”，但并未提出具体的物质基础。李柠岑等[12]通过回输针刺后血清外泌体，产生了“类针刺样”作用，提出外泌体可能是联系穴位与脏腑的重要载体。外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小囊泡，直径约30～150 nm，广泛分布于各种体液中，囊泡内所荷载的DNA、miRNA、蛋白质、转录因子及脂质等生物活性物质，通过循环系统可以到达全身的器官、组织、细胞，从而参与调控细胞及细胞间的相互作用，并与疾病发生发展密切相关[13-14]。基于以上特性，有学者指出，外泌体与经络具有高度的相通性，它们均具备全身广泛分布、携带生命信息、靶向性、动态性、双向调节性等特点，既能反映机体生理功能，也可反映病理变化[15]。艾灸通过其具有的温热作用、药物作用、光辐射特性等综合因素作用于人体体表[16]，中间通过大量的网络调节，最终综合作用于靶器官，其作用机制是否与外泌体有关？本研究结果显示，对照组血清外泌体浓度低于实验组，提示外泌体可能是艾灸发挥作用的靶点。

“带瘤生存”是中医治疗肿瘤的重要学术观点[17]，现已被医学界广泛认可，肿瘤临床疗效评价也由单一的瘤体控制率转变为以患者生存期、主观感受、生活质量等多方面的评价标准[18]。《诸病源候论》指出：“积聚者，由寒气在内所生也”，认为“阳虚寒凝”是肿瘤主要病机之一，而“灸者温暖经络，宣通气血，使逆者得顺，滞者得行”“夫灸取于火，以火性热而至速，体柔而用刚，能消阴翳，走而不守，善入脏腑”[19]，以灸法补益正气、扶正培本是“带瘤生存”的有效治疗手段[20]。本实验研究发现，艾灸可增加三阴性乳腺癌荷瘤小鼠的生存期，通过电镜观察、粒径分析、外泌体表面标记蛋白检测对小鼠血清外泌体进行了确认，实验组血清外泌体浓度明显高于对照组，因此我们推测，艾灸干预乳腺癌机制与调控血清外泌体有必然联系。目前本研究处于前期阶段，后续将针对外泌体来源、外泌体荷载的生物活性物质深入研究。