圣草酚通过调控c-Myc/AR轴对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

刘汉成，李慧明，张 杰，孟庆来，丁 实，马立辉

乳腺癌是世界范围内女性癌症死亡的主要原因[1]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)作为乳腺癌的亚型之一，具有高转移、高侵袭、高复发等特点，并且是所有乳腺癌类型中预后最差的一种[2]。TNBC由于雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)及人类上皮细胞生长因子受体2(human epithelial growth factor receptor 2，Her2)表达均为阴性，导致患者无法从内分泌治疗及Her2靶向治疗中获益。目前，放化疗仍是治疗TNBC的主要手段，但耐药性、并发症以及毒副作用的产生会导致患者预后不佳，并不能有效延长患者的生存期。因此，寻找新型、安全、有效的抗肿瘤药物，提高治疗效果，是当今TNBC研究的热点。圣草酚(eriodidoyol，Eri)是一种天然化合物，不仅对部分肿瘤细胞有明显的抗肿瘤活性[3-5]，而且还对人体毒副作用小。此外，原癌基因c-Myc作为一种关键的转录因子，参与肿瘤的发生发展[6]。雄激素受体(androgen receptor，AR)是核受体家族的一员，在10%～43%的TNBC患者中均有表达[7]。已有研究[8]表明，激活c-Myc/AR轴可促进ER(-)/Her2(+)乳腺癌的恶性发展，但其对TNBC的影响还尚未见报道。该研究基于c-Myc/AR轴，探究Eri对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响，以期为临床TNBC的治疗开拓更多的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.1.2主要试剂 Eri(纯度≥98%，批号：Y12O8H4553)购自上海源叶生物科技有限公司；4%多聚甲醛固定液购自上海碧云天生物技术有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、MTT试剂盒、姬姆萨染色原液(×10)、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白质检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；L15培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自上海赛百慷生物技术股份有限公司；引物序列购自武汉天一辉远生物科技有限公司；siRNA购自上海吉玛基因科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine® RNAiMAX、逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自美国Introvigen公司；Cleaved-caspase-3抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、c-Myc抗体、AR抗体、GAPDH抗体均购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HPR)标记的山羊抗兔/鼠二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.1.3主要仪器 CO2培养箱(型号：MCO-18AC)购自日本松下公司；全自动酶标仪(型号：MR-96A)购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；流式细胞仪(型号：NovoCyte 2040R)购自美国ACEA公司；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7300)购自美国Thermo公司；化学发光成像仪(型号：Tanon-5200)购自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 MDA-MB-231细胞用含有10%胎牛血清的L15培养基进行培养，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中，细胞密度达90%以上时，用胰蛋白酶消化传代。

1.2.2细胞转染 取对数期MDA-MB-231细胞消化接种于6孔板中，待细胞密度生长至70%～80%，使用Lipofectamine® RNAiMAX将含有c-Myc干扰RNA序列(si-c-Myc)的质粒载体及其阴性对照质粒载体(si-NC)转染至MDA-MB-231细胞中，将细胞依次分为si-c-Myc组和si-NC组，另设置对照组(Control组)。置于培养箱6 h后更换新鲜的完全培养基，继续培养48 h，然后采用qRT-PCR和Western blot检测转染效率。

1.2.3细胞分组及处理 将MDA-MB-231细胞分为空白组(blank组)：MDA-MB-231细胞未经任何处理；Eri组：MDA-MB-231细胞经50 μmol/L Eri处理48 h；si-c-Myc组：MDA-MB-231细胞转染si-c-Myc质粒载体；si-c-Myc+Eri组：MDA-MB-231细胞转染si-c-Myc质粒载体后再经50 μmol/L Eri处理48 h。

1.2.4MTT法检测细胞增殖 以2 000个/孔的细胞密度将对数期MDA-MB-231细胞接种于96孔板，培养过夜。加入终浓度为0、1.0、7.5、15.0、30.0、60.0和120.0 μmol/L的Eri分别培养12、24、48 h或按照上述分组处理；提前4 h向每孔中加入20 μl MTT溶液，避光孵育4 h，吸掉上清液，每孔中加入150 μl DMSO，暗处振荡10 min，用酶标仪测570 nm处的吸光度值，计算IC50值。

本文主要针对上海市典型的城市道路施工产生的噪声和扬尘影响提出有针对性的环境保护措施，为工程建设和环境管理提供科学依据，做到既发展经济又保护环境，进而实现可持续发展，同时为城市道路工程施工期的环境保护提供相关技术和方法参考。

1.2.5平板克隆形成实验检测细胞增殖克隆能力 取对数期MDA-MB-231细胞以1 000个/孔的细胞密度接种于6孔板，待细胞完全贴壁后分别加入0、12.5、25和50 μmol/L Eri处理细胞48 h，更换新鲜的完全培养基继续培养。每4 d换液1次，并于显微镜下观察细胞群落形成情况。待孔板中细胞群落形成足够明显，弃培养基，加入PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛固定液固定20 min，弃固定液，避光条件下加入姬姆萨染色工作液(×1)，室温染色20 min，弃染色液，用蒸馏水洗涤残留染色液，充分晾干，在显微镜下观察后用高清相机拍照，并计算每组细胞的克隆数量。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数期MDA-MB-231细胞以2.0×104个/孔的细胞密度接种于6孔板，待细胞完全贴壁后分别加入0、12.5、25和50 μmol/L Eri处理细胞48 h或按照上述分组处理。收集各组细胞，加入PBS清洗1次后，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行实验操作，使用400 μl缓冲液制备细胞悬液，依次加入AnnexinV-FITC、PI染色液各5 μl，混悬细胞后避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.7qRT-PCR检测c-Myc表达 收集转染后的各组细胞，使用TRIzol试剂提取细胞中总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，并使用qRT-PCR试剂盒进行PCR扩增。将10 μl qPCR混合物及每种引物0.5 μl混合均匀，配制成最终的20 μl反应混合物。用于扩增的热循环参数如下：94 ℃变性2 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环；25 ℃ 5 min终止反应，构建熔解曲线并在62 ℃和95 ℃之间进行分析，采用2-△△Ct法计算c-Myc相对于内参基因GAPDH的表达水平。c-Myc引物F：5′-CAGAAAUGUCCUGAGCAAUUU-3′，R：5′-AUUG CUCAGGACAUUUCUGUU-3′。GAPDH引物F：5′-CCCACATGGCCTCCAAGGAGT-3′，R：5′-GTGTACAT GGCAACTGT-GAGG-3′。

1.2.8Western blot法检测 收集细胞沉淀，使用RIPA缓冲液冰上充分裂解30 min，然后以14 652 r/min离心15 min，收集上清液，使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白质含量。取30 μg蛋白经沸水浴变性后，采用SDS-PAGE电泳，分离蛋白，再将蛋白转移到PVDF膜上，经50 g/L脱脂奶粉溶液室温封闭 2 h，加入Cleaved-aspase-3、Bax、Bcl-2、c-Myc、AR、GAPDH抗体(1 ∶500)在4 ℃下孵育过夜。TBST清洗3次，将膜与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔/鼠二抗(1 ∶10 000)在室温下孵育1 h，TBST清洗3次，滴加ECL显影液显色。用Image J软件分析目的蛋白相对表达量。

2 结果

图1 Eri对MDA-MB-231细胞增殖的影响与0.0 μmol/L Eri组比较：*P<0.05

2.2 Eri对MDA-MB-231细胞克隆能力的影响如图2所示，不同浓度Eri处理后，MDA-MB-231细胞克隆数量逐渐降低(F=171.291，P<0.05)。与0 μmol/L组比较，12.5、25.0、50.0 μmol/L Eri处理后MDA-MB-231细胞群落变小，细胞克隆数量显著减少(P<0.05)。

图2 Eri对MDA-MB-231细胞克隆能力的影响与0.0 μmol/L Eri组比较：*P<0.05

2.3 Eri对MDA-MB-231细胞凋亡的影响如图3、4所示，不同浓度(0、12.5、25.0、50.0 μmol/L)Eri处理后，MDA-MB-231细胞凋亡率逐渐升高(F=73.392，P<0.05)，Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平逐渐上调(F=188.351、167.587，P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达水平逐渐下调(F=53.894，P<0.05)。

图3 Eri对MDA-MB-231细胞凋亡的影响与0.0 μmol/L Eri组比较：*P<0.05

2.4 Eri对MDA-MB-231细胞中c-Myc和AR表达的影响如图5所示，不同浓度(0、12.5、25.0、50.0 μmol/L)Eri处理后，MDA-MB-231细胞中c-Myc和AR蛋白表达水平逐渐降低，差异有统计学意义(F=483.772、476.831，P<0.05)。

图5 Eri对MDA-MB-231细胞中c-Myc和AR蛋白表达水平的影响与0.0 μmol/L Eri组比较：*P<0.05

2.5 Eri和沉默c-Myc对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及c-Myc/AR轴的影响如图6所示，与Control组比较，si-c-Myc组细胞中c-Myc mRNA和c-Myc蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，而si-NC组无显著变化(P>0.05)。如图7所示，与blank组比较，Eri组和si-c-Myc组细胞增殖活性显著降低(P<0.05)，凋亡率显著升高(P<0.05)，c-Myc和AR蛋白表达水平显著下调(P<0.05)；与Eri组比较，si-c-Myc+Eri组细胞增殖活性显著降低(P<0.05)，凋亡率显著升高(P<0.05)，c-Myc和AR蛋白表达水平显著下调(P<0.05)；与si-c-Myc组比较，si-c-Myc+Eri组细胞增殖活性、细胞凋亡率、c-Myc和AR蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。

图6 转染后各组细胞中c-Myc mRNA和蛋白表达水平

图7 Eri和沉默c-Myc对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及c-Myc/AR轴的影响与blank组比较：*P<0.05；与Eri组比较：#P<0.05

3 讨论

Eri是一种广泛存在于蔬菜、水果及中药中的天然二氢黄酮化合物，具有抗炎、抗氧化以及保护神经等多种药理活性。此外，有研究指出，Eri具备一定的抗肿瘤活性，如Tang et al[9]研究表明，Eri通过抑制MEK/ERK信号通路激活来抑制鼻咽癌CNE1细胞增殖、迁移和侵袭。Lv et al[10]研究表明，Eri通过阻断P38 MAPK/GSK-3β/ZEB1信号通路来实现对胶质母细胞瘤A172和U87 MG细胞迁移和侵袭的抑制作用。但Eri对TNBC的影响还尚不知晓。该研究结果显示，Eri可呈浓度和时间依赖性抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能与调控c-Myc/AR轴有关。

图4 Eri对MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平的影响与0.0 μmol/L Eri组比较：*P<0.05

AR是核受体家族的一员，属于配体激活的转录因子，易被睾酮及其代谢物二氢睾酮等雄激素所激活，活化后的AR会进入细胞核中，与下游的靶基因启动子区结合，调控靶基因的转录，最终影响细胞的功能[11]。目前，已有大量研究显示，AR在多种癌症发病机制中起到关键作用，例如，王长林 等[12]报道AR抑制剂氟他胺能明显抑制胶质瘤细胞系U251细胞的侵袭与迁移。Wang et al[13]研究显示AR通过调控ASS1P3/miR-34a-5p/ASS1信号通路促进肾细胞癌RCC细胞增殖。该研究结果显示，Eri可呈浓度和时间依赖性抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，提高凋亡率，上调Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平，下调Bcl-2蛋白表达水平，说明Eri对MDA-MB-231细胞发挥促凋亡作用。进一步研究表明，不同浓度Eri处理可降低MDA-MB-231细胞中AR蛋白表达水平，提示Eri抑制MDA-MB-231细胞增殖并诱导其凋亡可能与AR有关。任秋宇 等[14]研究也表明抑制AR的活性可一定程度上诱导三阴性乳腺癌BT549细胞凋亡。随后，该研究还表明不同浓度Eri酚处理可下调MDA-MB-231细胞中c-Myc蛋白表达水平，表明Eri可抑制MDA-MB-231细胞中c-Myc的表达。

c-Myc作为原癌基因Myc家族成员之一，参与细胞增殖、代谢、蛋白质合成等重要生命活动，尤其是在肿瘤中。以往研究[15]指出，c-Myc在多种肿瘤细胞中处于高活化状态，敲低其表达可抑制癌细胞增殖进而抑制肿瘤的发展。为进一步研究Eri是否是经c-Myc/AR轴对MDA-MB-231细胞发挥抗癌作用，该研究沉默c-Myc基因表达后联合Eri进行干预，结果显示，c-Myc基因沉默可显著抑制MDA-MB-231细胞增殖活性，促进其凋亡，并下调AR蛋白表达。然而，Eri联合处理不能增强c-Myc基因沉默对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用和凋亡的促进作用，表明阻断c-Myc/AR轴后Eri不能经过其他途径对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡产生影响。

综上所述，Eri可抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与调控c-Myc/AR轴有关。该研究结果可为TNBC的临床用药提供新的思路，但仍需更多的研究进行探讨和验证。