小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落结构研究

赵宏岩， 谭君伟， 张杰， 陈浩楠， 王春旭， 赵地，李海鹏， 朱李霞， 韩毅强

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）

绿豆、小豆同属豆科豇豆属作物，是我国主要的食用豆类，黑龙江省是其主要产区[1-2]。小豆、绿豆在种植过程中，根部病害发生普遍[3]，一般会造成10%～30%的减产，严重时可达50%以上，甚至绝收[4]。

杂豆常见病害包括茎腐病、炭疽病、枯萎病以及锈病等，其中，茎腐病是一种由多种真菌混合感染的土传病害，主要危害杂豆根系[3]，患病植株发病后期通常造成植物根茎部腐烂、有褐色病斑等症状，病重时会造成幼苗死亡[5]。真菌被认为是导致杂豆病害的主要原因[6]，在已知的植物病害中，70%～80%是由真菌引起，按照侵染部位又可以分为根部病害、茎基部病害和叶部病害[7]。

目前，对杂豆茎基感病部化真菌群落的鉴定主要基于传统的划线分离纯化手段，吉雯雯等[8]对小豆根腐部位真菌进行了鉴定，发现致病菌以镰刀菌属为主，主要包括腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌；闫强等[9]在感染根腐病的绿豆根系中检测到树栖交链孢菌、细极链格孢菌、茄病镰刀菌和玉蜀黍丝核菌等多种真菌。传统的鉴定方法步骤繁琐、工作量大、耗时长，且目前可培养的微生物仅占自然界全部微生物的1%左右，因此，依赖于平板培养技术来研究植株感病部位真菌群落具有很大的局限性[10]。

真菌广泛分布在植物根、茎、叶、花、果等器官内外[12]，其群落结构的组成和多样性与植物的生长发育密切相关[11]。所以，研究作物感病部位真菌群落分布对确保小豆和绿豆增产具有重要意义。高通量测序技术已广泛应用于环境、食品及动物、植物、微生物群落多样性的研究[13-14]。因此，本研究以小豆和绿豆茎基感病部位为研究对象，采用Illumina高通量测序技术对其真菌群落进行了分析，明确成熟期感病的小豆与绿豆茎基真菌的分布及其关联性，为进一步研究小豆和绿豆感病部位真菌群落的致病机理奠定基础。

1 材料及方法

1.1 田间试验与取样

将绿豆品种大明绿和小豆品种珍珠红于2019年5月20日播种于黑龙江省五大连池地区的大庆农场试验田（东经126.041 851°、北纬48.727 148°），播种面积32.5 m2，垄距65 cm、株距7 cm，均采用正常田间管理；于9月10日选取15株侧根干枯并大部分已经腐烂、表面有褐色病斑及白色菌丝的作物进行下一步分析。

1.2 样品的预处理

选取感病的小豆（XDR）和绿豆（LDR）植株各3株。将采集到的茎基样品用无菌水冲洗，用75%乙醇消毒处理后用无菌水冲洗干净，继续用0.5%次氯酸钠浸泡2 min，无菌水再次冲洗后用无菌纱布包裹样本至沥干水分。切取茎基样品0.5 cm段进行标记，小豆样品标记为XDR1、XDR2、XDR3，绿豆样品标记为 LDR1、LDR2、LDR3，-80℃保存备用。

1.3 DNA提取

①取1 g样品至离心管中，研磨成粉状，加入800 μL水浴到65℃的CTAB后颠倒，放置水浴锅中1 h；②离心取上清液加入等体积的氯仿/异戊醇混合液（24∶1），充分混匀，室温下离心；③取上清，重复步骤②2～3次；④取上清液加入2倍体积的无水乙醇颠倒，静置；⑤离心，用75%乙醇洗涤2次后倒掉上清，自然风干沉淀物；⑥加入50 μL ddH2O浸泡5～10 min，弹动或振荡充分溶解DNA[15]。

1.4 ITS（internally transcribed spacer）文库的构建及高通量测序

DNA经琼脂糖凝胶电泳检测和浓度测定后用于PCR扩增真菌的ITS区，利用真菌通用引物，引物序列为 ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3’)和 ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3’)；扩增体系 20 μL；PCR 反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环；72℃ 7 min[16]。PCR扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后用于构建文库，利用HiSeq 2500平台（北京百迈客生物科技有限公司）进行双端高通量测序。

1.5 数据处理与分析

使用FLASH v1.2.7软件通过overlap对每个样品的reads进行拼接，得到拼接序列（raw tags）[17]；使用 Trimmomatic v0.33软件对 raw tags进行过滤，得到高质量数据（clean tags）[18]；使用UCHIME v4.2软件鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据（effective tags）[19]。使用Usearch软件对effective tags在97%的相似度水平下进行聚类，获得OTU，并基于UNITE（真菌）分类学数据库对OTU进行分类学注释。使用Mothur v1.30软件对样品Alpha多样性指数进行评估，包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数。

2 结果与分析

2.1 小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落的分布规律

以Illumina HiSeq测序平台对ITS片段进行高通量测序，结果如表1所示。6个样品测序共得到453 847条有效序列，每个样品至少产生75 052条有效序列，其中，小豆平均产生75 774条有效序列，绿豆平均产生75 252条有效序列。小豆有效序列的平均长度为240 bp，绿豆有效序列的平均长度为255 bp，绿豆的OTU数量较多。样本稀释曲线均表现为先急剧上升，然后随着测序条数的增加趋于平缓（图1A），文库的覆盖度均在99.9%以上，说明测序的结果较为合理。根据小豆和绿豆样品的Venn图（图1B）可知，小豆的OTU数为101，绿豆的OTU数为130个；2组样品中共有的OTU数为97个，而绿豆特有的OTU为33个，小豆特有的OTU为4个。

表1 小豆和绿豆茎基样品测序的Tags信息及OTU统计分析Table 1 Tags information and OTU statistical analysis of adzuki bean and mung bean stem-based samples sequencing

图1 茎基感病部位真菌的测序稀释曲线及Venn图Fig.1 Sequencing dilution curve and venn diagram of fungi in susceptible parts of stem

2.2 小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落分析

2.2.1 门水平 小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落在门水平上的组成结构和丰度如图2所示，优势菌门均为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），在小豆和绿豆中的相对丰度分别为68.93%、3.52%和55.17%、8.22%。其中，子囊菌门（Ascomycota）在小豆与绿豆中都占有绝对优势。另外，2种作物中未分类菌门也较多，分别占28.00%和36.58%。

图2 真菌群落在门水平的相对丰度Fig.2 Relative abundance of fungi communities at phylum level

2.2.2 纲水平 小豆和绿豆茎基感病部位的真菌群落在纲水平上的结构组成和丰度结果如图3所示 ，粪 壳 菌 纲（Sordariomycetes）、散 囊 菌 纲（Eurotiomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）和伞菌纲（Agaricomycetes）为小豆和绿豆茎基感病部位真菌的优势菌纲，在小豆和绿豆中的相对丰度分别为45.70%、14.01%、9.19%、3.24%和41.65%、3.52%、9.40%、7.98%。其中，粪壳菌纲是小豆和绿豆茎基感病部位的主要优势菌纲。

图3 真菌群落在纲水平的相对丰度Fig.3 Relative abundance of fungi communities at class level

2.2.3 目水平 小豆和绿豆茎基感病部位的真菌群落在目水平上的结构组成如图4所示。肉座菌目（Hypocreales）、曲霉菌目（Eurotiales）、假球壳菌目（Pleosporales）、小丛壳菌目（Glomerellales）、煤炱菌目（Capnodiales）和雞油菌目（Cantharellales）为小豆和绿豆茎基感病部位的真菌群落共同的优势菌目，在小豆和绿豆中的相对丰度分别为40.65%、14.01%、5.70%、4.82%、3.47%、3.19% 和 27.14%、3.52%、6.32%、1.10%、3.08%、2.67%。除以上菌目外，粪壳菌目（Sordariales）、伞菌目（Agaricales）和Myrmecridiales在绿豆茎基感病部位真菌中的相对丰度也较高，分别为6.90%、5.25%和2.08%。

图4 真菌群落在目水平的相对丰度Fig.4 Relative abundance of fungi communities at order level

2.2.4 科水平 小豆和绿豆茎基感病部位的真菌群落在科水平上的结构组成如图5所示，从赤壳科（Nectriaceae）、曲霉科（Aspergillaceae）、圆孔腔菌科（Pleosporaceae）、枝孢霉科（Cladosporiaceae）和角担菌科（Ceratobasidiaceae）为2种作物的共同优势菌科，在小豆和绿豆中的相对丰度分别为40.34%、14.01%、3.31%、2.77%、3.19%和26.17%、3.52%、2.31%、2.82%、2.67%。 除 此 之 外 ，Plectosphaerellaceae、小双腔菌科（Didymellaceae）、小丛壳科（Glomerellaceae）在小豆中的相对丰度较高，分别为3.07%、2.11%和1.74%；而毛球壳科（Lasiosphaeriaceae）、格孢腔菌科（Sporormiaceae）和脆柄菇科（Psathyrellaceae）在绿豆中的相对丰度较高，分别为6.83%、5.25%和2.06%。

图5 真菌群落在科水平的相对丰度Fig.5 Relative abundance of fungi communities at family level

2.2.5 属水平 小豆和绿豆茎基样品真菌群落在属水平上的结构组成如图6所示，镰刀菌属（Fusarium）、曲霉菌属（Aspergillus）、链格孢属（Alternaria）和芽枝霉属（Cladosporium）为小豆和绿豆共同优势菌属，在小豆和绿豆中的相对丰度分别为32.94%、11.92%、3.22%、2.77%和18.38%、2.88%、1.36%、2.82%。鳞球菌属（Plectosphaerella）、青霉属（Penicillium）、Boeremia、炭疽菌属（Colletotrichum）在小豆中的相对丰度较高，分别为2.96%、2.09%、1.35%、1.18%；柄 孢 壳 菌 属（Podospora）、Myrmecridium、光 黑 壳 属（Preussia）和 鬼 伞 属（Coprinellus）在绿豆中的相对丰度较高，分别为6.78%、2.08%、2.06%和5.52%。

图6 真菌群落在属水平的相对丰度Fig.6 Relative abundance of fungi communities at genus level

2.2.6 种水平 小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落在种水平上结构组成如表2所示，均含有大量未知菌种，在小豆和绿豆中分别占91.21%和81.30%。Plectosphaerella oratosquillae、歧皱青霉菌（Penicillium steckii）和Boeremia sambuci nigrae在小豆中为优势菌种，相对丰度分别为2.96%、1.87% 和 1.35%；而Podospora communis、Coprinellus curtus和Preussia terricola为绿豆中的优势菌种，相对丰度分别为6.20%、5.25%和2.06%。Clonostachysmiodochialis和歧皱青霉菌（Penicillium steckii）为小豆与绿豆茎基感病部位共同存在的菌种，分别属于Clonostachys和青霉菌属（Penicillium）。

表2 真菌群落在种水平的相对丰度Table 2 Relative abundance of fungi communities at species level

2.3 小豆和绿豆茎基感病部位的真菌多样性分析

由表3可知，小豆茎基感病部位真菌群落的ACE指数和Chao1指数显著低于绿豆，表明绿豆茎基感病部位的真菌群落丰度高于小豆茎基感病部位的真菌群落丰度；而Simpson指数和Shannon差异不显著，表明小豆和绿豆茎基感病部位的真菌群落多样性水平相近。

表3 小豆和绿豆真菌群落Alpha多样性Table 3 Alpha diversity of fungal communities in adzuki bean and mung bean

3 讨论

本研究对小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落进行高通量测序，揭示了2种作物茎基感病部位的真菌群落组成，其中，小豆样品真菌主要分布于2个门7个纲17个目31个科44个属36个种；绿豆样品真菌主要分布于4个门13个纲23个目42个科54个属45个种。对优势菌属分析发现，镰刀菌属（Fusarium）在小豆和绿豆茎基感病部位均为优势菌属，分别占总鉴定菌属的32.94%和18.38%。目前，镰刀菌属在小豆和绿豆致病菌中报道的较少。Kondo等[20]指出，在患枯萎病的小豆植株中镰刀菌属占有一定优势；李薇[21]也发现，绿豆感病部位存在属于镰刀菌属的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schlecht）、茄腐镰刀菌（F.solani(Mart)Sacc）等。除镰刀菌属外，链格孢属（Alternaria）也是小豆和绿豆茎基感病部位的共同菌属，相对丰度分别为3.22%和1.36%。彭芳芳等[22]通过高通量测序发现，链格孢属在感染菌核病的桑果中为优势菌属，相对丰度为2.03%。除共有菌属外，小豆茎基感病部位的优势菌属还包括炭疽菌属，相对丰度为1.18%。研究表明，炭疽菌属在感染炭疽病的大豆和豇豆中为优势菌属[23]。优势菌种分析发现小豆茎基感病部位的病原菌种包含短肥镰刀菌（Fusarium brachygibbosum），此菌种为患根腐病大豆的优势菌种[24]。绿豆茎基感病部位真菌的优势菌种中含有多主棒孢菌（Corynespora cassiicola），此菌种在患根腐病的大豆中也被检测到[25]。除已知菌外，在小豆和绿豆茎基感病部位的真菌群落中还发现了大量未分类菌种及许多未知菌种，这些未知菌种有待进一步分析。