腺苷酸活化蛋白激酶活化cofilin诱导小动脉舒张的机制研究

张永梅，曾贤德，曾雄，闵曦曦，陈炜，邱结华

（南昌大学第二附属医院 1.检验科 2.血管外科，江西南昌 330006）

小动脉为阻力动脉或阻力血管，一般是指直径200～500 μm 的动脉，其在维持机体血压稳态和调节组织血供中发挥重要作用[1-4]。正常情况下，其具有一定的紧张性，从而维持机体正常血压[5]，调节器官和组织的血液灌注，而病理状态将导致多种心血管系统疾病[6-7]。因此，小动脉功能调节机制的研究对心血管系统疾病的防治有非常重要价值。小动脉舒缩功能的调控取决于两个方面[8-9]，第一、游离Ca2+浓度；第二、Ca2+敏感性（非Ca2+依赖），其中包括细胞骨架肌动蛋白（actin）稳态的调节[10-11]。

腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）被称为“能量调节器”[12-15]，机体中广泛分布，在调节机体能量代谢和供需平衡方面发挥重要作用[16]。随着AMPK 研究的深入，近年来发现其下游靶蛋白的数量和种类众多，具有多种生物学效应。动物体内实验研究[17]表明非特异性活化AMPK 可以降低动脉血压。在最近的两项研究中发现，AMPK 可通过血管平滑肌肌浆/内质Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic/endoplasmic Ca2+-ATPase，SERCA）调节因子phospholamban 和BKCa通道调节Ca2+浓度，及通过调控细胞骨架actin 的稳态来调节小动脉舒张（Ca2+敏感性）[10,18-19]。

前期研究[10]发现AMPK 通过14-3-3 蛋白的协助增加cofilin 去磷酸化，从而增加cofilin 活性，促进细胞骨架链状肌动蛋白（filamentous actin，F-actin）蛋白降解为单体肌动蛋白（globular actin，Gactin）。目前在小动脉中14-3-3 蛋白协助cofilin 去磷酸化的具体机制尚有待研究，本研究通过小鼠肠系膜上动脉研究AMPK 活化cofilin 的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL6/N 小鼠20 只（上海宝牧实验动物养殖场），雌雄不限，年龄8～12 周。所有操作均严格遵循动物实验相关规程。

1.2 动脉的分离和处理

方法如文献[18]报道。简要如下：断头处理小鼠，固定四肢，酒精喷洒消毒，切开皮肤皮下组织及腹壁，于肠系膜上动脉根部切断，完整解剖游离肠系膜，用冷冻MOPS 缓冲液保存。在显微镜下按动脉分级分离肠系膜上动脉。取第II、III 级动脉用于实验。

1.3 血管功能实验

按照文献[10]的方法进行实验：采用压力myograph 模型，MOPS 液为缓冲液、血管压力维持在60 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），水浴加温至37 ℃，并确保后续实验均在37 ℃恒温下进行。首先，采用1 μmol/L 肾上腺素和30 μmol/L 乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）处理进行功能检测，选取收缩率[（血管起始直径-收缩后直径）/血管起始直径]＞30%及舒张率[（舒张后血管直径-收缩后直径）/（血管起始直径-收缩后直径）]＞90%的动脉用于后续实验。主要实验步骤如下：⑴用含SERCA抑制剂Thapsigargin（1 μmol/L）且无Ca2+的MOPS 预处理血管5 min；⑵采用高钾（125 mmol/L）+Ca2+（0.5 mmol/L）+Thapsigargin（1 μmol/L）的MOPS 溶液预收缩肠系膜上动脉5 min；⑶分别加入AMPK激活剂PT1 30 μmol/L 和DMSO（PT1 溶剂）处理血管60 min，比较激活与非激活AMPK 状态下肠系膜上动脉扩张程度；⑷血管功能实验后收集各组血管，快速液氮处理，-80 ℃保存，用于后续的分子实验。

1.4 AMPK下游靶蛋白检测

收集的标本在液氮下碾成粉末状，1×SDS 液裂解蛋白，Brandford 法蛋白定量，用Western blot 法检测GAPDH、磷酸化AMPK（p-AMPK）、磷酸化cofilin（p-cofilin）的表达。用免疫荧光Western blot法检测β-actin、热休克蛋白20（heat shock protein 20，HSP20）及磷酸化HSP20（p-HSP20）。实验血管中G-actin 水平检测：标本按照G-actin/F-actin In Vivo Assay 试剂盒的说明步骤进行处理（Cytoskeleton，Inc.，美国）[20]。

1.5 统计学处理

各种检测蛋白表达量均为与内参GAPDH 或β-actin 标准化值，采用SPSS 10.0 软件进行数据分析，所有数据均以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管功能实验结果

血管活性功能检测显示两组血管活性功能无显著差异：PT1 组与对照组对1 mmol 肾上腺素收缩率分别为（37.25±1.86）%、（36.83±2.12）%，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1A）。PT1 组与对照组对30 μmol/L Ach 舒张率分别为（98.92±1.68）%、（97.83±1.95）%，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1B）。1 μmol/L Thapsigargin 无Ca2+的MOPS 预处理后PT1 组和对照组血管直径分别为（261.4±12.4）μm 和（260.3±12.5）μm，差异无统计学意义（P＞0.05）。预收缩5 min 后，PT1 组和对照组血管直径分别为（134.5±6.3）μm、（135.3±7.7）μm，差异无统计学意义（P＞0.05）。PT1 或DMSO 处理60 min 后，PT1 组血管明显扩张至（196.6±11.5）μm，对照组血管直径为（136.1±8.1）μm，差异有统计学意义（P＜0.001）（图1C）。

2.2 相关蛋白表达情况

与对照组比较，PT1 组血管组织中p-AMPK 水平明显升高，而p-cofilin 水平明显降低分别为对照组的（3.25±0.52）倍、（0.48 ±0.19）倍，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图2）；与对照组比较，PT1 组血管组织中G-actin 水平明显升高，为对照组的（2.26±0.64）倍，差异有统计学意义（P＜0.01）（图3）；与对照组比较，PT1 组血管组织中总HSP20（t-HSP20）水平无明显变化，但p-HSP20 水平明显升高，为对照组的（2.45±0.52）倍，差异有统计学意义（P＜0.001）（图4）。

3 讨论

小动脉在机体血压稳态和调节组织血供中发挥重要作用[16]。前期通过体外完整小动脉（小鼠肠系膜上动脉）研究证实AMPK 可以通过非血管内皮细胞依赖的两种不同通路调节VSMC 胞浆游离Ca2+浓度从而调节VSMC/血管的舒缩[18]、也可以通过增加cofilin 活性降低细胞骨架F-actin 稳态而扩张血管[10]。本研究进一步揭示AMPK 是通过HSP20 活化cofilin，从而发挥其促进F-actin 去聚化功能，降低细胞骨架稳态，降低VSMC 对Ca2+敏感性，从而导致血管扩张。

通过各种条件刺激VSMC，使膜电位改变[21]，其胞浆游离Ca2+浓度升高，Ca2+与肌钙蛋白结合，从而激活收缩单位：肌动蛋白（主要为F-actin）、肌球蛋白沿F-actin 长轴滑行，从而导致肌细胞收缩[22-23]。当胞浆游离Ca2+浓度维持不变，如本研究采用高渗钾溶液诱导细胞膜电位改变，VSMC 收缩能力的强弱主要由F-actin 稳态决定。血管功能实验发现，当激活AMPK 时，血管获得缓慢扩张，说明VSMC 收缩能力降低，即细胞骨架稳态发生改变，主要表现为F-actin 去聚化加强。此也间接表明促进F-actin 去聚化相关因子活性提高。

越来越多的证据[24-25]表明细胞骨架稳态在调节肌细胞舒缩中发挥重要作用。细胞骨架主要由actin 构成，其为微丝的结构蛋白，它是真核细胞中表达最丰富的蛋白质，以两种形式存在，即单体（G-actin）和多聚体（F-actin）[25-26]。细胞骨架稳态主要为F-actin 的稳态，肌细胞收缩的重要环节为磷酸化的肌球蛋白轻链与F-actin 发生桥接反应，从而使肌细胞收缩[22]。F/G-actin 处于聚化和去聚化动态平衡，受到多种actin 结合蛋白和去聚化蛋白调节，如cofilin、VASP、Arp2/3complex 及paxillin 等[25]。Miranda 等[27]在上皮细胞中证实AMPK可以通过Rho/ROK-cofilin 通路调控细胞骨架稳态。近期在血小板的研究也发现AMPK 通过调节VASP及cofilin 磷酸化水平来调控细胞骨架的重组[28-29]。同时有研究[28]表明AMPK 调节actin 稳态在细胞移行功能中发挥重要作用，发现AMPK 可以通过其新型靶点Pdlim5，抑制Arp2/3 信号途径，从而降低G-actin 聚化抑制细胞移行。前期研究发现活化AMPK 能通过增加cofilin 的活性（即非磷酸化cofilin水平）从而扩张肠系膜上动脉[10]。本研究延续前期研究，进一步证实AMPK 活化血管中G-actin 含量显著升高，而p-cofilin 活化水平显著降低，说明活化AMPK 能增加F-actin 去聚，降低细胞骨架稳态，且此机理为cofilin 活性增强。

AMPK 为磷酸激酶，其降低cofilin 磷酸化水平依赖于间接途径。前期研究发现在小鼠肠系膜上动脉中主要依赖14-3-3 蛋白来实现[10]。此外有研究[30-32]发现磷酸化转导HSP20 可能通过与p-cofilin竞争结合14-3-3 蛋白发挥调节F-actin 稳态的功能。本研究在延续前期实验的基础上，发现活化AMPK时，血管p-cofilin 水平降低的同时p-HSP20 水平相应升高。增加的p-HSP20 将与p-cofilin 竞争14-3-3蛋白结合位点，从而使p-cofilin 游离、易于被去磷酸化，增加其活性。活化cofilin 促进F-actin 去聚化，降低细胞骨架稳态性，从而诱导血管扩张。

总之，在小鼠小动脉中，HSP20 参与协助AMPK 活化cofilin，主要为活化AMPK 可以增加p-HSP20 水平，竞争结合p-cofilin 位点，使其去磷酸化，增加cofilin 活性，从而降低细胞骨架actin 稳态，调节血管舒缩。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。