猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因重组DNA疫苗的构建及其免疫效果评价

魏春华，黄夏玲，杨 圆，何 乐，林志锋,2，徐 叶,2，黄文琳,柳开隆，戴爱玲，杨小燕，刘建奎

(1 龙岩学院 a生命科学学院，b福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，c 预防兽医学与生物技术福建省高校重点实验室，福建 龙岩 364000;2福建农林大学 动物科技学院，福建 福州 350002)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)于1987年首次在美国报道以来，现已传播至大多数养猪国家，成为一种全球性的猪病毒性传染病，给世界各国带来巨大的经济损失[1-3]。目前，基于Shi等[4]Type 2 PRRSV的分类系统，我国的流行毒株可分为4个谱系：谱系1(NADC30-like)、谱系3(QYYZ-like)、谱系5.1(VR2332-like)、谱系8.7(JXA1-like和CH-1a)，各个谱系间毒株序列存在较大差异，其中处于谱系8.7的HP-PRRSV和谱系1的NADC30-like株是我国流行的优势毒株[5-6]。当前，免疫弱毒苗或灭活苗是防控PRRS的主要手段，两种疫苗对同源性毒株均能产生良好的免疫效果，而对于异源性毒株交叉免疫保护作用较差。2012年国内出现了NADC30-like毒株，该类毒株间基因组高度变异，易于与其他毒株包括疫苗株发生重组，导致商品化疫苗无法提供良好的免疫保护[7-9]。研究表明，PRRSV侵入后，机体主要产生针对病毒GP5蛋白的中和抗体，因此GP5蛋白成为研制新型疫苗的首选蛋白[10-12]。近年来，PRRSV变异速度明显加快，导致现有疫苗对其交叉保护性较差，这迫切需要研制安全有效的疫苗来防控PRRS。DNA疫苗是一种极具发展前景的基因工程疫苗，可诱导细胞和体液免疫应答，成为新型疫苗的研究热点和开发方向。

DNA改组技术(DNA shuffling)又称有性PCR技术，可以使基因在分子水平上进行重组，从而获得含有多个亲本基因的突变体，在生物工程领域得到了广泛应用，特别是在改造病毒载体、细胞因子、启动子抗体及目的蛋白等方面显现出巨大的应用潜力[13-18]。研究人员将不同谱系PRRSV的不同基因通过DNA改组成功构建出具有感染性的嵌合病毒，动物试验证实嵌合病毒能对异源毒株产生良好的交叉保护作用[16-18]。目前，PRRSV毒株多且弱毒疫苗株与野毒株频频发生重组，导致现有疫苗不能有效预防PRRS，因此本研究利用DNA 改组技术对不同谱系PRRSV的ORF5基因进行重组构建DNA疫苗，以期对异源性毒株产生良好的交叉保护效果，为进一步研发安全、有效的PRRSV DNA重组疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、毒株及主要试剂

pCAGGS-HA(pCA-HA)载体质粒、pCA-ORF5-MLV(ORF5基因来自疫苗株Ingelvac PRRS MLV)质粒，以及PRRSV谱系1毒株FJ-Chen、FJ-Huang和FJ-Yang(GenBank登录号分别为MZ322854、MZ322857、MZ322861)、谱系3毒株FJ-Deng和FJ-Liu(GenBank登录号分别为MZ322861、MZ322858)、谱系5.1毒株FJ-Wang(GenBank登录号为MZ322860)、谱系8.7毒株FJ-Qiu和FJ-Fu(GenBank登录号分别为MZ322859、MZ322856))和MARC-145细胞，均由福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室保存；小鼠抗HA一抗，购自北京义翘神州科技有限公司；Lp8000转染试剂盒、ECL超敏发光试剂盒及HRP标记的羊抗鼠IgG、Cell Counting Kit(CCK8)，购自碧云天生物技术有限公司；山羊抗鼠IgG荧光抗体(FITC标记)，购自美国Sigma公司；弱毒活疫苗Ingelvac PRRS MLV，购自勃林格殷格翰动物保健(中国)有限公司；无内毒素大提质粒试剂盒，购自Omega公司；小鼠白介素4(IL-4)及干扰素γ(IFN-γ)ELISA试剂盒，购自西塘科技有限公司；PRRSV GP5蛋白抗体(PRRSV-GP5)ELISA试剂盒，购自上海润裕生物技术有限公司；PE标记的鼠抗CD4抗体、FITC标记的鼠抗CD8抗体，购自Biolegend公司；BALB/c小鼠,购自闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司。

1.2 重组突变体质粒的构建

按照文献[19]的方法设计PRRSVORF5基因引物，交由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，引物序列为，P1：5′-CACTTCATGACACCTGAGAC-3′，P2：5′-AAGGCATATATCATTATTGGCGT-3′。按照文献[19-20]的方法，利用DNA改组技术构建重组突变体质粒，具体过程为：提取FJ-Chen、FJ-Huang、FJ-Yang、FJ-Deng、FJ-Liu、FJ-Wang、FJ-Qiu和FJ-Fu毒株的RNA，采用RT-PCR方法扩增ORF5基因，电泳后回收PCR产物。对回收的PCR产物用DNase Ⅰ酶进行酶切，获得多个50～100 bp的小片段，以其为模板进行无引物和有引物PCR扩增，将扩增产物与pMD-19T载体连接构建重组突变体质粒，将重组突变体质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑选200个含有重组质粒的菌落送往北京睿博兴科生物技术有限公司测序，利用DNAStar和MEGA 6.0等生物学软件对测序结果进行序列比对，筛选含有PRRSV 4个谱系ORF5基因的重组突变体质粒。

1.3 重组表达质粒的构建

将重组突变体质粒和真核表达载体pCAGGS-HA分别用BamH Ⅰ和XhoⅠ进行双酶切后进行连接，构建重组表达质粒并将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取重组表达质粒，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，阳性克隆交由北京睿博兴科生物技术有限公司测序鉴定。

1.4 重组质粒在MARC-145细胞中表达的检测

将MARC-145细胞均匀平铺在6孔细胞培养板上，于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养，次日待细胞铺满培养板孔80%左右时,用Lp8000转染试剂盒将重组表达质粒转染至MARC-145细胞，具体操作按试剂盒说明书进行。采用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting试验(WB)对重组表达质粒在MARC-145细胞中的表达情况进行检测。

间接免疫荧光试验(IFA)：向上述转染重组表达质粒MARC-145细胞的6孔板中,每孔放1张细胞爬片，培养48 h后用体积分数4%多聚甲醛固定，依次以小鼠抗HA蛋白抗体(1∶800倍稀释)为一抗， FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1 600 倍稀释)为二抗，分别于37 ℃孵育1 h，加50 μL DAPI细胞核染色液，再于37 ℃避光孵育10 min，用TBST清洗2次(每次3 min)，PBS洗涤后以中性树脂封片，晾干后置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。试验以未转染目的基因的MARC-145细胞为阴性对照。

Western blotting检测(WB)：对转染48 h的MARC-145细胞进行收样，加入RIPA蛋白裂解液使细胞膜溶解后，进行SDS-PAGE并转膜，以鼠抗HA蛋白抗体(1∶800倍稀释)为一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，HRP标记的山羊抗小鼠为二抗(1∶1 600 倍稀释)，37 ℃孵育1 h，进行Western blotting检测。试验以未转染目的基因的MARC-145细胞为阴性对照。

采用无内毒素大提质粒试剂盒提取重组表达质粒(pCA-ΔORF5-8、pCA-ΔORF5-46)，即得PRRSVORF5基因DNA重组疫苗，对其纯度、浓度、RNA和残留蛋白质进行检测[21]。

1.5 PRRSV ORF5基因DNA重组疫苗免疫效果检测

取48只6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，随机分为6组，每组8只。第1组为PBS空白对照组，第2组为pCAGGS-HA空载体组，第3组为弱毒疫苗组(经典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV，MLV组)，第4组为pCA-ORF5-MLV组(ORF5基因来自Ingelvac PRRS MLV)，第5和第6组分别为pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46(本试验构建)组。在pCA-ORF5-MLV组、pCA-ΔORF5-8组、pCA-ΔORF5-46组和pCAGGS-HA空载体组小鼠大腿内侧肌肉注射免疫相应的无内毒素重组质粒100 μg/只，PBS空白对照组小鼠大腿内侧肌肉注射PBS 100 μL/只，弱毒疫苗MLV组小鼠大腿内侧肌肉注射免疫弱毒疫苗100 μL/只[22]。各组均免疫3次，每次间隔14 d。

1.5.1 血清IL-4、INF-γ、PRRSV-GP5蛋白抗体水平检测及脾淋巴细胞增殖试验 采集免疫前(免疫0 d)及二免后2周(42 d)和三免后2周(56 d) 6组小鼠全血，析出血清，利用小鼠IL-4和INF-γ ELISA检测试剂盒检测小鼠血清中IL-4和INF-γ浓度。同时使用小鼠PRRSV GP5蛋白抗体ELISA检测试剂盒检测小鼠血清中的GP5蛋白抗体。免疫后56 d，按照动物福利要求的方法将小鼠处死，无菌取脾分离脾淋巴细胞，用灭活PRRSV作为特异性抗原刺激脾淋巴细胞，使用CCK8法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平。

1.5.2 血清中和试验 将采集的pCA-ΔORF5-8等6组小鼠56 d的血清灭活并进行2倍倍比稀释，分别与等体积100 倍TCID50的谱系1 FJ-Chen(病毒滴度为106.2TCID50/mL)、谱系3 FJ-Liu(病毒滴度为106.0TCID50/mL)、谱系5.1 FJ-Wang(病毒滴度为106.6TCID50/mL)和谱系8.7 FJ-Fu(病毒滴度为107.5TCID50/mL)毒株混合，采用固定病毒、稀释血清的方法进行血清中和试验，评价免疫小鼠血清对不同谱系PRRSV的中和能力[23]。

1.6 数据分析

运用IBM SPSS statistics和Graphpad Prism等分析软件对试验数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 重组突变体质粒的筛选

利用生物学软件DNAStar对测序结果进行分析，最终筛选出2个含有PRRSV 4个谱系部分ORF5基因(去除信号肽)的重组突变体质粒，命名为ΔORF5-8和ΔORF5-46。利用MEGA 6.0软件对基于核苷酸推导的氨基酸序列进行分析，结果显示，ΔORF5-8和ΔORF5-46重组突变体均含有PRRSV 4个谱系GP5蛋白(图1、图2)。

2.2 重组真核表达质粒的鉴定

重组真核表达质粒经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切，结果切出大小约为4 800 bp的pCAGGS-HA载体片段和465 bp的重组突变体片段(图3)，与预期结果相符。阳性克隆测序鉴定结果表明，成功构建了重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46。

M.DNA Marker DL5000；1.pCA-ΔORF5-8双酶切结果;2.pCA-ΔORF5-46双酶切结果

2.3 重组质粒在MARC-145细胞中的表达

将构建的重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46，转染MARC-145细胞48 h后，进行IFA与Western blotting 分析。IFA结果表明，转染pCA-ΔORF5-8重组表达质粒的细胞能检测到特异性绿色荧光，而正常对照细胞无特异性荧光(图4-A)；转染pCA-ΔORF5-46重组表达质粒的细胞结果与转染pCA-ΔORF5-8的细胞一致(图略)。Western blotting结果表明，转染pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46重组表达质粒的细胞样品在17 ku处出现目的条带(图4-B)。上述分析结果表明，重组质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46可在MARC-145中有效表达。

A.pCA-ΔORF5-8 IFA结果;B.Western blotting检测结果。1.阴性对照；2.pCA-ΔORF5-8；3.pCA-ΔORF5-46

2.4 免疫小鼠血清IL-4、INF-γ检测

IL-4检测结果(图5-A)显示，pCA-ORF5-MLV和pCA-ΔORF5-46免疫小鼠在42 d时血清IL-4水平较高，而MLV组和pCA-ΔORF5-8组在56 d时才达到相近的水平；免疫后42～56 d，pCA-ΔORF5-8组和pCA-ΔORF5-46组小鼠血清中IL-4水平极显著高于pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组(P<0.01)，而pCA-ΔORF5-8组与MLV组差异不显著(P>0.05)。INF-γ检测结果(图5-B)显示，pCA-ΔORF5-46免疫小鼠在56 d时血清IFN-γ水平最高，pCA-ΔORF5-8组和pCA-ΔORF5-46组小鼠血清IFN-γ水平极显著高于pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组(P<0.01)，与MLV组差异显著(P<0.05)。上述结果表明，重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46 均能诱导TH1类和TH2类细胞因子的分泌，从而提高机体的细胞及体液免疫应答水平。

图柱上标不同小写字母表示同类处理相比差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下图同

2.5 免疫小鼠血清中的PRRSV特异性中和抗体水平

在0,42和56 d分别对各组小鼠采血分离血清，使用小鼠血清PRRSV GP5蛋白抗体ELISA检测试剂盒检测GP5抗体水平。结果(图6)表明，与pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组相比，pCA-ΔORF5-8、pCA-ΔORF5-46、pCA-ORF5-MLV以及MLV组小鼠血清GP5抗体水平均极显著提高(P<0.01)；与42 d相比，56 d时pCA-ΔORF5-46组小鼠血清的GP5抗体水平较高，极显著高于弱毒疫苗MLV组，但极显著低于pCA-ORF5-MLV组。结果表明，重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46能刺激机体产生特异性抗体。

图6 PRRSV ORF5基因DNA重组疫苗免疫小鼠血清GP5抗体检测

2.6 免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应

无菌取小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，进行脾淋巴细胞增殖试验来评价疫苗诱发的细胞免疫应答。结果(图7)显示，pCA-ORF5-MLV、pCA-ΔORF5-8、pCA-ΔORF5-46和MLV组小鼠的脾淋巴细胞刺激指数(SI)极显著高于pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组(P<0.01)，表明重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能提高机体的细胞免疫应答水平。

2.7 免疫小鼠产生的中和抗体水平

由表1可知，在第3次免疫后14 d，pCA-ΔORF5-46组小鼠能对4个谱系毒株产生特异性中和抗体，对谱系1代表毒株FJ-Chen、谱系3代表毒株FJ-Liu、谱系5.1代表毒株FJ-Wang、谱系8.7代表毒株FJ-Fu产生的中和抗体的平均滴度分别为12，11，11和16；pCA-ΔORF5-8组小鼠能对谱系1、3和8.7代表毒株产生较高水平的特异性中抗体，对谱系1代表毒株FJ-Chen、谱系3代表毒株FJ-Liu、谱系8.7代表毒株FJ-Fu产生的中和抗体平均滴度分别为16，10和12；pCA-ORF5-MLV组小鼠对谱系5.1、谱系1代表毒株产生了较高水平的特异性中和抗体，抗体平均滴度分别为17和11；MLV组小鼠对谱系5.1、谱系8.7代表毒株产生的中和抗体的平均滴度为12和9；免疫空载体pCAGGS-HA和PBS空白对照组，均不能产生中和抗体。结果表明，pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46能诱导机体产生更有效的中和抗体，尤其是对近期流行的谱系1和谱系3的代表毒株免疫效果较好。

表1 PRRSV ORF5重组基因DNA疫苗免疫小鼠血清的中和抗体滴度

3 讨 论

目前，PRRS已遍布世界主要养猪国家和地区，成为严重妨碍养猪业健康发展的传染病之一。目前接种PRRSV灭活疫苗和弱毒疫苗是防控PRRS的主要方式，但灭活疫苗在灭活过程中易造成抗原表位的缺失或抗原性减弱，免疫猪只后不能产生强有力的免疫保护，而且抗体持续时间相对较短，需要多次免疫。弱毒疫苗不能对部分异源型毒株提供保护，在免疫选择性的压力下可能会导致毒株变异甚至疫苗毒力返祖，导致PRRS的再次暴发[24-26]。此外，目前猪场主要流行的类NADC30株易于与减毒活疫苗株发生重组，导致商品化疫苗无法提供良好的免疫保护，给我国的养猪业带来严峻挑战，因此有必要研制新型安全有效的疫苗防控PRRS[7-9]。基因工程疫苗是近年的研究热点和方向，研究人员希望通过基因工程技术研发出更加安全、有效的疫苗。ORF5基因编码的GP5蛋白作为PRRSV主要的结构蛋白，具有良好的免疫原性，GP5蛋白诱导产生的中和抗体与免疫保护性反应最为相关，成为研制新型疫苗的首选蛋白，但是GP5蛋白是PRRSV最易变异的蛋白之一，导致一种毒株产生的中和抗体不能对其他异源PRRSV产生良好的交叉保护[27]。研究人员利用DNA 改组技术对不同亚群PRRSV的基因进行重组改造构建嵌合病毒，经动物实验验证，所构建的 PRRSV 嵌合病毒可以诱导机体产生针对异源毒株的交叉中和抗体，说明DNA改组技术在开发有效的针对异源毒株保护的PRRS疫苗方面具有广阔的应用前景[17-19]。

在PRRSV GP5 N端中和表位(PNE)上游存在一个诱骗表位区A27/V27LVN30，可以诱导机体产生大量的非中和抗体，延迟机体针对PNE产生中和抗体[28]。因此本研究选取4个谱系8株PRRSV毒株的ORF5基因，利用DNA 改组技术进行体外基因重组，去信号肽和非中和表位，筛选出2个重组突变体(ΔORF5-8和ΔORF5-46)，其氨基酸同源性为93.5%。IFA和Western blotting证实，重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46能在MARC-145细胞中有效表达。用2个重组DNA疫苗(pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46)免疫小鼠后，均能刺激机体产生特异性的GP5蛋白抗体，与弱毒活疫苗组和pCA-ORF5-MLV组相比，免疫效果相近，表明重组质粒能刺激机体产生体液免疫应答。PRRSV中和抗体能够阻止病毒在肺泡巨噬细胞中的复制，可能在病毒的清除过程中起重要作用[29]。血清中和试验证实，2个重组DNA疫苗能刺激动物机体产生淋巴细胞增殖反应，并产生针对3～4个不同谱系尤其是谱系1和谱系3代表毒株的中和抗体，而pCA-ORF5-MLV组只能刺激机体产生针对谱系5.1和8.7毒株的中和抗体，表明2个重组DNA疫苗可能对异源性毒株起到交叉保护作用，但这还需要进一步通过猪只免疫保护性试验进行验证。

IFN-γ在机体细胞免疫中发挥着十分重要的作用，本研究中，ELISA检测结果表明，2个重组DNA疫苗组小鼠血清中IL-4和INF-γ细胞因子显著高于PBS空白对照组和pCAGGS-HA空载体组(P<0.05)，表明重组质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能有效诱导机体细胞免疫水平。因此本研究构建的DNA疫苗能有效刺激并诱导机体产生细胞及体液免疫应答，为研发PRRS新型基因工程疫苗提供了新的思路。此外，本研究也存在不足之处，如pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46组检测到的GP5抗体水平相对较低。研究表明，与单独表达的疫苗相比，融合表达CTLA4或GPX1与PRRSV ORF5的靶向疫苗能够诱导更好的免疫效果，因此后期本课题组将对重组质粒与细胞因子共表达、DNA疫苗与弱毒苗及灭活苗联合免疫或通过GP5-M融合表达等来提高疫苗的免疫效果[23,30-31]。此外，本研究结果是基于小鼠试验获得的，还不能真实客观地评价疫苗的免疫效果，疫苗是否能在宿主猪体内起到良好的免疫效果，尚有待进一步研究。