套袋对海沃德猕猴桃果实品质及叶绿素代谢的影响

陈 成，王 依，宋思言，杨 勇，万春雁，阎永齐

(1 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400；2 西安市阎良区农业技术推广中心，陕西 西安 710089)

猕猴桃为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(ActinidiaLindl.)植物，是我国重要的本土果树。猕猴桃于20世纪初开始人工驯化，是20世纪人工驯化最成功的果树之一。猕猴桃果实酸甜爽口，香气浓郁，富含维生素C、膳食纤维等多种营养成分，且具有低卡路里特征[1]，深受消费者喜爱。同时，果实色泽是果实品质的重要指标之一，且是果实商品价值的重要组成部分，其变化通常因叶绿素、类胡萝卜素、花青素等色素物质成分的组成比例不同而致。猕猴桃属有54种、21个变种，共计75个分类单元，且果肉颜色不尽相同[2]。就生产而言，栽培品种大致可以分为2类，一类是果肉黄色或果心红色的中华猕猴桃，另一类是果肉绿色的美味猕猴桃[3]。现阶段，对中华猕猴桃果实品质、果肉色泽的生理和分子层面研究较深[4-6]，而对绿肉猕猴桃相关研究较少。有研究表明，叶绿素存在于众多植物器官包括未成熟的果实中，当果实成熟时，果肉中的叶绿素通常会被降解[7]。而海沃德猕猴桃为典型的绿肉猕猴桃品种，果实成熟后仍有大量叶绿素存留在果肉中。因此，探明海沃德猕猴桃果实叶绿素代谢机制，既是果实品质改良的基础，也对栽培技术改良和科学管理有重要意义。

套袋是世界公认的人工干预果实接受光照的一种有效技术措施，可以有效地改善果实色泽，现已在果树生产中广泛应用。众多研究表明，套袋可以提高果面光洁度，改善果实的外观品质和内在品质[8-9]。在猕猴桃果实研究方面，套袋处理对改善果实外观品质、降低农药污染和提高果实商品性等具有明显作用[10-11]。本研究以海沃德猕猴桃为试材，采用外黄内黑单层袋、外黄内黑双层袋、白色单层袋、黄色条纹单层袋4种类型果袋进行果实套袋处理，测定并分析不同处理猕猴桃果实外观品质、内在品质、糖含量、果皮与果肉色泽变化、果实叶绿素含量与叶绿素代谢相关基因的表达情况，以期为解析光照对猕猴桃果实品质及叶绿素代谢机制的影响奠定基础，并为江苏丘陵地区猕猴桃产业升级和经济效益提升提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为树龄4年的海沃德猕猴桃，定植于江苏省镇江市农业科学院华阳园猕猴桃种植基地内，其砧木为美味猕猴桃实生苗。株行距2.8 m×3.0 m，南北行走向，大棚架种植。于盛花期后30 d，用4种类型果袋进行果实套袋处理，具体设计为：外黄内黑单层袋(处理A)、外黄内黑双层袋(处理B)、白色单层袋(处理C)、黄色条纹单层袋(处理D)，每种果袋随机套300个果实，以不套袋作为对照(CK)。于果实成熟后收获，立即测定相关指标并在液氮保护下研磨，-80 ℃储存。

1.2 试验方法

1.2.1 猕猴桃果实外观品质测定 于果实采摘后用游标卡尺测量果实纵径、横径及侧径；用电子天平称量果实单果质量。

1.2.2 猕猴桃果实内在品质测定 于果实达可食状态时，测定果实品质。果实可溶性固形物含量、总酸含量及固酸比使用手持式糖酸一体机(ATAGO，PAL-BX/ACID 8，日本)测定，果实干物质含量用烘干法测定，结果均以各指标的质量分数表示；果实硬度使用数显式水果硬度计(GY-4，浙江托普)测定。

1.2.3 猕猴桃果实糖含量测定 果实蔗糖、果糖及葡萄糖含量参照Chen等[12]的方法，利用气质联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)技术测定。

1.2.4 猕猴桃果皮和果肉色泽指标测定 使用可携式色差计(柯尼卡美能达，CR-400，日本)D65光源测定果皮及果实横切面果肉(图1)的L值(光泽明亮度)、a值(红绿色差指标)、b值(黄蓝色差指标)，以白板校正。每个处理测定5个果实，重复3次取平均值。根据a、b值计算综合色差指标色泽饱和度(C*)、色泽比(h)、色度角(h*)，其中C*=(a2+b2)1/2，h=a/b，h*=arc[tan(b/a)]。

图1 不同套袋处理海沃德果实果皮(Ⅰ)和果肉横切面(Ⅱ)

1.2.5 猕猴桃果实叶绿素含量测定 果实叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量使用叶绿素(Chlorophyll)检测试剂盒法(微板法)(TP1051，北京雷根)测定。

1.2.6 叶绿素代谢相关基因的实时荧光定量PCR 从TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥叶绿素合成和降解相关基因的蛋白序列，与猕猴桃本地蛋白质数据库(http://kiwifruitgenome.org/organism/5)进行比对，获得猕猴桃叶绿素合成和降解同源基因(表1)。

表1 猕猴桃叶绿素合成和降解的相关基因信息

使用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(Sangon Biotech)提取猕猴桃果实RNA，采用Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)第一链合成试剂盒(翌圣生物科技，上海)反转录RNA获得cDNA,用于qRT-PCR。根据荧光定量引物设计原则，使用PrimerQuest Tool(http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)设计引物，优先选择靠近基因3′端的引物(表2)，以EF1α为内参基因。使用Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus)试剂盒(翌圣生物科技，上海)进行荧光定量检测，定量仪器为AB-7500 (Applied biosystems 7500)。实时荧光定量条件为：预变性温度95 ℃，时间5 min；变性温度95 ℃，时间10 s，退火/延伸温度60 ℃，时间30 s，共计40个循环。熔解曲线条件为仪器默认值，使用2-ΔΔCt法对表达量进行分析[13-14]。

表2 猕猴桃叶绿素代谢相关基因的实时荧光定量PCR扩增引物及其序列

1.3 数据处理

采用Excel 2007软件进行数据整理，用SPSS 16.0分析软件进行统计和相关性分析，用one-way ANOVA方法对每个变量进行Turkey检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 套袋对猕猴桃果实品质的影响

由表3可知，不同套袋处理对海沃德猕猴桃果实纵径、横径、侧径及单果质量的影响均不显著。处理A、B果实纵径及单果质量较其他处理小，处理C果实纵径及单果质量最大，处理D果实横径最大，CK处理果实侧径最大。

表3 不同套袋处理对海沃德果实外观品质的影响

由表4可知，不同套袋处理对海沃德猕猴桃果实可溶性固形物含量的影响均不显著，果实的可溶性固形物含量以CK最高，达16.28%，以处理C最低，仅有15.43%。果实总酸含量以处理D最低，仅有0.28%，显著低于处理C和CK。果实固酸比以处理D最高，达57.29，显著高于处理C和CK。果实硬度以处理C最高，达1.68 kg/cm2，显著高于其他处理，其余各处理果实硬度均在1 kg/cm2以下。不同套袋处理对海沃德猕猴桃果实干物质含量的影响均不显著，以处理D果实的干物质含量最低，仅有17.44%。

由图2可知，套袋处理可以显著降低果实蔗糖含量，A、B、C、D 4个处理分别较CK降低了63.28%，36.85%，66.50%和51.52%。果实果糖含量以处理A最低，仅有86.42 mg/g，显著低于处理B和CK；以处理B最高，达105.14 mg/g，显著高于处理A和D。果实葡萄糖含量以处理A最低，仅有124.37 mg/g，显著低于处理B、C和CK；以处理B最高，达147.20 mg/g，显著高于处理A和D。

图柱上标不同小写字母表示经Turkey多重比较差异显著(P<0.05),下同

2.2 套袋对猕猴桃果实色泽的影响

不同套袋处理海沃德果皮及果肉色素指标的变化情况如图3所示。

图3 不同套袋处理对海沃德果皮及果肉色素指标的影响

由图3可知，就果皮而言，L值以处理B最高，显著高于处理C和CK。a值以处理B最高，显著高于处理C、D和CK；以处理C最低，仅有8.79，显著低于处理A和B。b值以处理B最高，达24.69，显著高于处理C、D和CK；以CK最低，仅有19.81，显著低于其他处理。套袋处理对C*值的影响与b值较为一致，以处理B最高，显著高于处理C、D和CK；以CK最低，显著低于处理A、B和D。h值以处理C最低，仅有0.40，显著低于处理A、B和CK；以CK最高，达0.49，显著高于处理B、C和D。h*值以处理C最高，达68.28，显著高于处理A、B和CK。就果肉而言，套袋处理对L值的影响与果皮较为一致，即处理A、B的L值显著高于处理C和CK；套袋处理对果肉a和h值的影响较为一致，处理A、B的a和h值为正值，处理C、D、CK的a和h值均为负值；套袋处理对果肉b和C*值的影响较为一致，处理A、B、D的b值和C*值均显著低于处理C和CK；与C*值类似，处理A、B、D的h*值显著低于处理C和CK。

2.3 套袋对猕猴桃果实叶绿素含量的影响

由图4可知，猕猴桃果实叶绿素a含量以CK处理最高，达4.48 mg/g，显著高于其他处理；以处理B最低，其与处理A差异不显著，但显著低于其他处理，较CK降低了93.20%。果实叶绿素b含量以CK处理最高，其与处理C差异不显著，但显著高于处理A、B和D；以处理B最低，仅有0.27 mg/g，显著低于其他处理，较CK降低了88.57%。果实总叶绿素含量以CK处理最高，达6.82 mg/g，显著高于其他处理；以处理B最低，仅有0.57 mg/g，显著低于其他处理，较CK降低了91.60%。

图4 不同套袋处理对海沃德果实叶绿素含量的影响

2.5 套袋对猕猴桃果实叶绿素代谢相关基因表达的影响

为了进一步研究套袋对果实颜色变化影响的相关机制，采用实时荧光定量PCR分析海沃德猕猴桃果实叶绿素合成和降解途径关键基因的表达，结果见图5和6。

图5 不同套袋处理对海沃德果实叶绿素合成基因相对表达量的影响

由图5可知，果实叶绿素合成基因AdCAO的表达丰度以处理C最低，且显著低于其他处理。AdRBCS1和AdRBCS2的表达丰度均以处理C最高，且显著高于其他处理。AdGLUTR1、AdGLU-TR2、AdGLUTR3的表达丰度均以处理D最高，其中处理DAdGLUTR1、AdGLUTR3的表达丰度显著高于其他处理，AdGLUTR2、AdGLUTR3的表达丰度均以处理C最低，且显著低于其他处理。

由图6可知，果实叶绿素降解基因AdCBR1的表达丰度以处理D最高，且显著高于其他处理，而其他处理之间AdCBR1表达丰度差异不显著。AdCBR2基因的表达丰度也以处理D最高，虽显著高于处理C，但与其他处理差异不显著。AdCBR3的表达丰度以处理C最低，且显著低于其他处理，而其他处理之间AdCBR3表达丰度差异不显著。AdPAO的表达丰度以处理D最高，显著高于处理A、B、C，但与CK差异不显著。AdSGR1的表达丰度以处理C最高，且显著高于其他处理。AdSGR2的表达丰度以CK处理最高，显著高于处理B、C、D，但与处理A差异不显著。AdPPH1、AdPPH2、AdPPH3的表达丰度均以处理D最高，其中Ad-PPH1、AdPPH3的表达丰度显著高于除CK外的其他处理，而AdPPH2的表达丰度显著高于其他所有处理。

图6 不同套袋处理对海沃德果实叶绿素降解基因相对表达量的影响

3 讨论与结论

随着社会经济的发展及居民生活水平的提高，消费者更加看重果品优质、绿色、安全等特征，果实套袋是果树优质高效安全生产的关键环节之一，并在果树栽培中大面积推广应用[15-17]。本研究发现，不同套袋处理对海沃德猕猴桃果实纵径、横径、侧径及单果质量的影响并不显著，说明套袋处理并未显著降低果实大小及单果质量，在对苹果[18]、梨[19]、毛花猕猴桃[20]等的相关研究中也得到了类似的结论。本研究还表明，不同套袋处理对海沃德猕猴桃果实可溶性固形物含量及干物质含量无显著影响；韩飞等[21]的研究表明，套袋处理可以促进‘金艳’猕猴桃提前成熟，但不同套袋处理对‘金艳’猕猴桃软熟时的可溶性固形物含量影响不同；而对‘红阳’猕猴桃而言，有研究表明，套袋处理显著降低了‘红阳’猕猴桃果实的可溶性固形物含量[22]；说明套袋处理对不同品种猕猴桃果实品质的影响程度不同。果实中糖的种类及其比例直接关系到果实的甜度和风味，本研究测定不同套袋处理海沃德果实的蔗糖、果糖及葡萄糖含量，发现不同套袋处理对猕猴桃果实蔗糖含量的影响较大，CK处理果实的蔗糖含量显著高于其他套袋处理，这与常晓晓等[23]报道的有机肥+套袋处理苹果桃果实蔗糖含量显著低于有机肥处理的结果相符。本研究表明，处理B果实的蔗糖含量显著高于处理A、C和D，果糖和葡萄糖含量显著高于A和D，由此可知，双层袋处理较单层袋更有助于果实各类糖分的积累。

套袋处理后，果实表面可以避免阳光直射造成灼伤和果面颜色不均匀，果实外观色泽鲜艳。在本研究中，套袋处理对猕猴桃果皮及果肉色泽均有很大影响。在色泽参数测定中，处理A、B、D果实的L值较高，即果面亮度高，而处理D和CK则果面暗淡。处理C、D和CK果肉的a值和h值为负值，果肉颜色表现为绿色，且处理C和CK果实a值和h值的绝对值大，果肉较处理D更绿。处理C和CK果肉的b值和C*值显著高于其他处理，说明白色单层袋和不套袋处理的果肉颜色更加鲜明。叶绿素和类胡萝卜素均是果实色泽组成的重要成分，在辣椒[24]、胡萝卜[25]及甜橙[26]中，果实变黄是由类胡萝卜素含量增加引起的。但是，在猕猴桃果实中，有研究认为，中华猕猴桃果实成熟后变黄是由于果实叶绿素的消失，而不是果实类胡萝卜素含量增加所致[27]。因此，本试验重点研究了套袋对猕猴桃果实叶绿素含量的影响，结果表明，处理C和CK果实的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均显著高于其他处理，说明与白色单层袋和不套袋处理相比，套深颜色袋和双层套袋处理均能显著降低果实的叶绿素含量。

果实叶绿素含量由其生物合成和降解之间的平衡决定，并且受遗传和环境的调控[28]。在本研究中，CK果实中AdCAO的表达丰度显著高于其他处理，暗示套袋处理使得其生物合成途径受到抑制[7]。而处理C果实中AdRBCS1的表达丰度显著高于其他处理，可能暗示白色单层袋处理有利于AdRBCS1表达量的提高。PPH蛋白为叶绿素降解代谢的关键酶[29]。有研究表明，绿肉猕猴桃和黄肉猕猴桃果实中，叶绿素降解基因PPH的表达模式相似，表明美味猕猴桃和中华猕猴桃果肉色泽的差异并不是PPH表达差异导致的[7]。在本研究中，处理D果实中AdPPH1、AdPPH2及AdPPH3的表达丰度均最高，其中，处理D 的AdPPH1表达丰度显著高于处理A、B及C，AdPPH2的表达丰度显著高于其他处理，表明黄色条纹单层袋处理有利于AdPPH表达量的提高，尤其是AdPPH2可能参与了叶绿素降解过程。这些叶绿素合成相关基因表达丰度的降低及降解相关基因表达丰度的提高，可能是导致套袋果实叶绿素降解的主要原因。

综上所述，套袋处理对海沃德猕猴桃果实大小、单果质量、可溶性固形物含量、干物质含量等果实品质指标的影响并不显著；果实蔗糖含量显著降低，从而改变了果实糖组分所占比例；果皮及果肉颜色明显变化，叶绿素含量降低；同时套袋处理导致果实叶绿素合成相关基因AdCAO表达丰度显著下调，黄色条纹单层袋处理导致降解相关基因AdCBR1、AdPPH2表达丰度显著上调。