高效液相色谱法同时测定口腔溃疡油中盐酸达克罗宁和醋酸氯己定含量*

2022-07-11熊英，雷健，邢茂

中国药业 2022年13期

熊英，雷健，邢茂

（中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院药学部，重庆 400037）

口腔溃疡油主要由醋酸氯己定、醋酸泼尼松龙、盐酸达克罗宁、冰片、鞣酸等配伍制成，可改善口腔溃疡症状，治疗口腔溃疡的疗效显著。其中，醋酸氯己定可杀菌、消炎［1-3］；醋酸泼尼松龙有抗炎作用［4］；盐酸达克罗宁有止痛功效［5］；冰片可止痛消肿［6］；鞣酸可减轻皮肤或黏膜的炎症，在炎症表面使蛋白质形成一层保护膜，减轻外界对神经末梢的刺激作用，消除痛觉和局部血管的扩张反应［7-8］。口腔溃疡油原质量标准未完全解决鞣酸对主要成分测定的干扰，以及醋酸氯己定的色谱峰形的展宽和拖尾问题［9］。本研究中建立了同时测定口腔溃疡油中醋酸氯己定和盐酸达克罗宁含量的高效液相色谱（HPLC）法［10-13］，以提高口腔溃疡油的质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），包括G7114A VWD 检测器和Chemstation 工作站；PB-10 型pH 计（上海雷磁仪器有限公司）；ME235S型电子天平（德国Sartorius公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

口腔溃疡油（陆军军医大学第二附属医院制剂室，批号分别为141219，150310，150416，150506）；盐酸达克罗宁对照品（批号为100423-201102，含量为99.8%），醋酸氯己定对照品（批号为100183 - 201003，含量为96.2%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，美国Honeywell 公司）；磷酸二氢钾（色谱纯，阿拉丁试剂＜上海＞有限公司）；冰醋酸（分析纯，重庆川东化工集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）- 0.02 mol/ L KH2PO4溶液（B，冰醋酸调pH 至2.5），梯度洗脱（0～20 min 时45%A，20～21 min 时45%A～60%A，21～30 min 时60%A，30～31 min 时60%A～45%A，31～35 min 时45%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：259 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

取醋酸氯己定对照品25 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，用初始比例流动相［甲醇- 磷酸盐缓冲液（45∶55，V/V）］溶解并定容，摇匀，作为醋酸氯己定对照品浓溶液。取盐酸达克罗宁对照品25 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，精密量取醋酸氯己定对照品浓溶液5 mL，加入同一容量瓶中，用流动相溶解并定容，摇匀，即得混合对照品贮备液。精密量取混合对照品贮备液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

取样品，用移液管精密量取2 mL，置200 mL容量瓶中，用甲醇分次洗涤移液管内壁，洗液并入容量瓶中。加甲醇适量，振摇使溶解，再加流动相稀释并定容，摇匀，即得供试品溶液。

按处方工艺配制缺醋酸氯己定和盐酸达克罗宁的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果相邻峰之间的分离度均大于1.5，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：精密量取2.2项下混合对照品贮备液10 mL，置50 mL 容量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，即得200%对照品溶液。分别精密量取200%对照品溶液8，6，5，4，3，2 mL，置10 mL 容量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得盐酸达克罗宁和醋酸氯己定的回归方程分别为Y盐=15 505.066 3X盐-1.709 0，r= 0.999 8（n =7）；Y醋= 31 759.537 6X醋-7.048 2，r=0.999 8（n=7）。结果表明，盐酸达克罗宁和醋酸氯己定的质量浓度分别在39.23～196.17 μg/mL和3.87～19.35 μg/mL 范围内与各自峰面积的线性关系良好。

1. 盐酸达克罗宁 2. 醋酸氯己定A. 阴性对照品溶液 B. 混合对照品溶液 C. 供试品溶液图1 高效液相色谱图1.Dyclonine hydrochloride 2.Chlorhexidine acetate A.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果盐酸达克罗宁和醋酸氯己定峰面积的RSD分别为0.35%和0.43%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为141219）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液6 份，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算盐酸达克罗宁和醋酸氯己定的含量。结果的RSD分别为0.50%和0.63%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为141219）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果盐酸达克罗宁和醋酸氯己定峰面积的RSD分别为0.55%和0.59%（n=6），表明供试品溶液在室温放置10 h内基本稳定。

加样回收试验：取醋酸氯己定对照品适量，精密称定，置50 mL容量瓶中，加流动相溶解，制成醋酸氯己定对照品浓溶液。取盐酸达克罗宁对照品适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，精密量取醋酸氯己定对照品浓溶液20 mL，加入同一容量瓶中，用流动相溶解并定容，摇匀，作为混合对照品贮备液。精密量取已知含量的供试品溶液1 mL（盐酸达克罗宁9.638 mg/mL，醋酸氯己定0.948 mg/mL），共9 份，置200 mL 容量瓶中，分别加入混合对照品贮备液8，10，12 mL，用流动相稀释并定容，摇匀。按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性试验：取样品（批号为141219）适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，适当调整色谱条件参数，在不同色谱条件下测定样品含量，考察方法的耐用性。结果盐酸达克罗宁和醋酸氯己定含量的RSD分别为0.95%和1.37%（n= 9），表明不同色谱条件对测定结果均无显著影响，方法耐用性良好。

2.4 样品含量测定

取3 批（批号分别为150310，150416，150506）样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图。按外标法以峰面积计算盐酸达克罗宁和醋酸氯己定的含量，结果见表2。

表2 盐酸达克罗宁和醋酸氯己定含量测定结果（%）Tab.2 Results of content determination of dyclonine hydrochloride and chlorhexidine acetate（%）

3 讨论

3.1 检测波长选择

样品中盐酸达克罗宁浓度是醋酸氯己定的10 倍，故同时测定盐酸达克罗宁和醋酸氯己定时选择醋酸氯己定的最大吸收波长（259 nm）作为检测波长，此波长处盐酸达克罗宁的吸光度也能满足检测要求。

3.2 色谱柱和流动相选择

醋酸氯己定结构中含有多个仲胺基和亚胺基，与硅胶表面的硅醇基有较强的氢键作用和亲硅醇基效应［14-16］，使用常用的十八烷基硅烷键合硅胶柱，并尝试用不同流动相检测醋酸氯己定，其色谱峰的拖尾均较严重。为了改善峰形，使各组分能选择性地分离，选择辛烷基硅烷键合硅胶柱，以甲醇- 0.02 mol/ L KH2PO4溶液为流动相。试验中发现，降低流动相的pH能显著改善醋酸氯己定的峰形，同时，考虑色谱柱对pH的耐受性，调节流动相pH 值至2.5。用以上色谱条件检测样品，可使干扰成分鞣酸在5 min 内快速出峰，且大幅减少鞣酸的色谱峰拖尾，很好地解决了鞣酸对主成分测定的干扰，使盐酸达克罗宁、醋酸氯己定和鞣酸的色谱峰均达到基线分离。