多发性内分泌腺肿瘤综合征临诊应对——1 个多发性内分泌腺瘤2A 型家系报道

龚晓娟 ，李和平 ，万沣霆 ，樊丽娅 ，刘 淑 ，刘霄炫 ，李雨欣 ，郭 辉 ，贺雅毅

（1. 西安交通大学第一附属医院内分泌代谢科，陕西西安 710061；2. 西安交通大学医学部法医学院，陕西西安 710061）

多发性内分泌腺瘤病（multiple endocrine neoplasia, MEN）是一组多个不同的内分泌腺肿瘤或者增生在同一个体先后或同时发生、以功能亢进为主要表现的遗传性疾病。根据病因及肿瘤组合不同，MEN可分为MEN1 及MEN2。按照2015 年美国甲状腺协会（ATA）最新发布的《甲状腺髓样癌管理指南修订版》，MEN2 分为 2 个亚型：MEN2A 及 MEN2B，并且将MEN2A 进行了新的分类[1]。其中经典型MEN2A最为常见，可同时并发甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤和（或）甲状旁腺功能亢进。目前，国内外已报道超过1 000 例的MEN2A 散发或家系病例，由于不同腺体的肿瘤或者增生先后出现，如果未能详细询问家族史，可能会导致疾病的漏诊及治疗延迟。故在临床中早期明确诊断MEN2A，对患者治疗方式的选择以及遗传干预有重要意义。本研究通过对1 例疑诊甲状腺髓样癌的患者进行家族史的深入探究，对先证者及其家系成员进行临床诊疗分析及致病基因鉴定，追溯出家系中多例甲状腺髓样癌患者，1 例嗜铬细胞瘤患者及2 例甲状旁腺功能亢进症患者。通过临床筛查及基因鉴定使多名家系成员得到及时救治及随访，避免了病情延误。本研究通过探讨MEN2A 患者的临床表现、分子标记物以及基因型与表型间的关系，旨在提高临床医师对甲状腺髓样癌以及可能潜在的多发性内分泌腺肿瘤的重视和认识，提高疾病的诊断率，为早期诊治创造时机。

1 对象与方法

1.1 研究对象

在西安交通大学第一附属医院住院的临床诊断为MEN2A 的家系1 个。本研究经西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理批件号：XJTU1AF2021LSK-267）。家系内所有参与研究的成员均签署知情同意书。对经手术确诊为甲状腺髓样癌的6 例先证者及其家系成员进行详细病史回顾及资料收集（人口统计学资料、现病史、既往史、家族史及包括甲状腺B 超、降钙素和其他系统评估资料在内的辅助检查结果），绘制家系图，完成RET基因检测。

1.2 主要先证者病史

以本次就诊的主要先证者（Ⅲ-10）为主线对病史展开叙述。52 岁女性，主因“发现甲状腺结节3 月”入院。无颈部疼痛，无吞咽及呼吸困难，无怕热、多汗等不适。查体：甲状腺未触及明显肿大，无压痛，双侧颌下淋巴结肿大，表面光滑，无压痛。辅助检查包括如下。

甲状腺B 超见甲状腺左叶8 mm×7 mm×7 mm极低回声结节，边界清，内可见点状强回声；右叶19 mm×6 mm低回声结节，内似可见强回声点。诊断“甲状腺右叶结节TI-RADS5 类，甲状腺左叶结节TI-RADS 4 类”。

甲状腺肿瘤标志物：降钙素增高为135.8 pg/mL(正常：0～6.4 pg/mL)，CEA 升高为 8.32 ng/mL（正常：0～5 ng/mL）；甲状旁腺激素升高为125.7 pg/mL（正常：15～65 pg/mL），维生素D3为9.6 ng/mL。甲状旁腺扫描提示甲状腺左叶上极后方结节灶，组织代谢增高，考虑功能亢进之旁腺组织可能。甲状腺功能、24 h尿儿茶酚胺、垂体磁共振及肾上腺CT 均正常。

先证者Ⅲ-10 疑诊甲状腺髓样癌，行甲状腺全切术+双侧颈部Ⅵ区淋巴结清扫，术后病理示甲状腺左叶髓样癌、右叶甲状腺髓样癌，无淋巴结转移。

1.3 主要先证者的家族史

1 个堂兄（Ⅲ-4）及 2 个侄子（Ⅳ-2，Ⅳ-7）曾因甲状腺疾病行手术治疗，后经证实病理均为甲状腺髓样癌。

家系筛查及回顾：先证者1（Ⅲ-10）证实甲状腺髓样癌后对其家系部分成员进行甲状腺B 超及甲状腺肿瘤标志物筛查，抽取外周血行RET原癌基因检测，并对既往家系中已经确诊为甲状腺髓样癌的家系成员进行病例回顾。

1.4 RET 原癌基因检测样本的准备

分别采集先证者及其家系成员的外周血于抗凝管中。用血液基因组DNA 提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取外周血样本DNA，用DENOVIX 超微量分光光度计（上海生物科技有限公司）检测DNA 浓度及纯度，并储存于-80 ℃。

1.5 PCR 扩增及RET 原癌基因突变检测

从 UCSC 数据库（http://ucscbrowser.genenetwork.org/）获 取RET原癌基因 的 DNA 序列，使用NCBI-Primer 设计甲状腺髓样癌RET基因常见突变位点的引物6 对，由西安擎科生物有限公司进行合成，引物序列如表1 所示。采用PCR 技术进行DNA扩增，反应体系为 50 μL，包括 2×Master Mix 25 μL（西安润德生物技术有限公司），上下游引物各2 μL，超纯水 18 μL，DNA 样本 3 μL。PCR 反应条件：预变性 95 ℃ 3 min，变性 94 ℃ 30 s，退火 57 ℃ ～59 ℃（根据引物的不同进行调整）30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，终端延伸72 ℃5 min。反应结束后取3 μL 反应产物，置于20 g/L 琼脂糖凝胶中电泳分离产物，对扩增产物进行检测。选取片段位置正确的条带进行Sanger 测序检测，测序由西安擎科生物有限公司完成。测序结果用DNA 序列分析软件Chromas 进行分析，结合人工校对，记录后整理结果。

表1 RET 突变位点PCR 扩增引物Tab. 1 PCR primers for RET mutation

1.6 统计学处理

致病性及保守性分析：利用在线软件Uniport（https://www.uniprot.org/）获取RET基因的 蛋白ID、FASTA 序列以及突变所在氨基酸位置，分析其在不同物种间的保守性。利用PolyPhen-2 软件（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml）分析突变位点的致病性，HumDiv 和HumVar 模型均被评估。其中HumDiv 模型用来评估稀有等位基因、通过全基因组关联研究确定区域的密集作图和自然选择分析，HumVar 是孟德尔遗传病诊断的首选模型，它从所有剩余的人类变异(包括大量的轻度有害等位基因)中区分出具有严重影响的突变。

2 结 果

2.1 先证者及家系成员的一般情况及临床特点

收集了36 个家系成员的人口统计学资料（包括年龄、性别、家系关系），部分家系成员完成甲状腺功能、降钙素、CEA 水平检测（表2）及甲状腺超声检查（表3）。其中经手术病理证实为甲状腺髓样癌者6 人，2 人合并原发性甲状旁腺功能亢进症，1 人合并嗜铬细胞瘤。家系成员的家系图谱如图1 所示。

图1 多发性内分泌腺肿瘤2A 型患者的家系图Fig.1 Pedigree of MEN2A family

2.2 RET 突变检测及临床资料分析结果

家系成员中有28 个家系成员（先证者Ⅳ-2 及其他7 位家系成员未采血）进行了致病基因RET的突变鉴定（表2），发现先证者10 号外显子上RET基因有1 个杂合子错义种系点突变，每个突变携带者在RET中都只有1 个单点突变，均为c.1852T＞A，其编码的蛋白质第618 位的氨基酸由半胱氨酸变成了丝氨酸(p.Cys618Ser)（图 2），而 8、11、14、15 和 16 外显子中未发现任何RET突变。此外，除先证者外的其他家系成员中无证据表明RET存在双突变或缺失/插入。PolyPhen2 软件预测该突变可能具有致病性，其中HumDiv 模型预测得分为0.999，敏感性为0.14，特异性为0.99；HumVar 模型预测得分为0.968，敏感性为0.61，特异性为0.93。突变位点周围区域与各种直系同源序列的多重比对显示，p.Cys618Ser 在不同物种间高度保守。

图2 先证者RET 基因10 号外显子发生杂合错义突变c.1852T＞A，导致p.Cys618SerFig. 2 Heterozygous missense mutation of c.1852T＞A,causing TGC（Cys）to TCC（Ser）at codon 618, in exon 10 of the RET proto-oncogene was detected in the proband

进行RET基因检查的28 名家系成员中，13 名(46.4%)检测到RETCys618Ser 突变。在 13 例RET突变携带者中，12 例进行了甲状腺功能、降钙素水平检测及超声学检查，结果显示12 例RETCys618Ser突变基因型携带者家系成员甲状腺功能均正常，而血清降钙素水平均有不同程度升高（表2）。上述12 例RETCys618Ser 突变基因型携带者家系成员均有甲状腺超声学异常改变（表3），其中3 例家系成员（Ⅳ-12、Ⅴ-2 及Ⅴ-10）表现为甲状腺双叶滤泡囊肿，年龄分别为33、10、7 岁，其余均表现为低回声及混合回声结节，部分结节内钙化。家系成员Ⅳ-3 基因型为野生型，但体检时发现甲状腺左叶实性结节，大小22 mm×14 mm，伴钙化，但自测降钙素水平正常，甲状腺结节经细针穿刺排除恶性病变。

表2 36 个家系成员的临床特点及RET 基因检测结果Tab.2 Clinical features and RET gene mutation of 36 family members

表3 13 例家系成员的甲状腺超声结果Tab.3 Ultrasound characteristics of 13 family mumbers

2.3 先证者资料分析情况

由于先证者Ⅳ-2 拒绝提供相关临床资料，本研究对其他5 例甲状腺髓样癌先证者进行详细病例回顾（表3），其中4 例先证者在基因筛查前已被诊断为甲状腺髓样癌；1 例（Ⅳ-1）在RET基因检测呈RET基因突变后进行甲状腺B 超及降钙素水平筛查，后经手术证实为甲状腺髓样癌；5 例先证者确诊甲状腺髓样癌时降钙素水平波动在135.8～2 000 pg/mL 以上。手术方式选择见表4，其中3 例手术中发现淋巴结转移。术后第2 天所有患者降钙素水平呈急剧下降趋势，后维持在正常水平或较术前明显降低；CEA 呈缓慢下降，至术后1月降至正常水平；3例患者出现一过性甲状旁腺激素水平下降及低钙血症，并伴有明显手足抽搐，经积极补钙，补充维生素D 等对症治疗后，血清甲状旁腺激素及血清钙逐渐恢复正常水平（表5）。

表4 5 例甲状腺髓样癌先证者的手术术式及病理Tab. 4 The operative methods and pathology of 5 probands with medullary thyroid carcinoma

表5 5 例甲状腺髓样癌先证者血清指标的随访记录Tab.5 The laboratory records of 5 probands with medullary thyroid carcinoma

3 讨 论

MEN2 是由RET基因突变引起的一组常染色体显性遗传性肿瘤综合征。MEN2A 约占所有MEN2患者的95%，又可分为4 个亚型：①经典型MEN2A指甲状腺髓样癌并发嗜铬细胞瘤和（或）甲状旁腺功能亢进，最为常见；②MEN2A 伴皮肤苔藓淀粉样变；③MEN2A 伴先天性巨结肠；④家族性非多发性内分泌肿瘤性甲状腺髓样癌（FMTC）[1-2]。由于MEN2A涉及多个腺体的肿瘤，而这些肿瘤往往不同时出现，经典型MEN2A 诊疗过程中需要与FMTC 进行鉴别。FMTC 为携带RET基因胚系突变但不合并嗜铬细胞瘤或甲状旁腺功能亢进症的甲状腺髓样癌，早在1986 年由法恩登(Farndon)及其同事首次报道，定义为家族成员中有超过10 名的甲状腺髓样癌患者，多名RET基因突变携带者或存在50 岁以上的成员患病[3]。随着对该病的逐步认识，发现最初被定义为FMTC 的家系（如RET密码子G533C 突变的六代巴西家系）在随访过程中家系成员逐渐出现嗜铬细胞瘤[4-5]。目前，大多数临床研究者观点是，FMTC 应该被认为是MEN2A 的一个变体，确诊需要足够长的观察时间。

本家系的诊断也是对MEN2A 的逐步明确过程，先证者Ⅲ-10 确诊甲状腺髓样癌之前，家系中已经有3 例成员确诊为甲状腺髓样癌，但是术前未针对嗜铬细胞瘤及甲状旁腺功能亢进症进行系统评估及家系成员的筛查。在对先证者Ⅲ-10 反复询问家族史后，初步怀疑该家系可能为FMTC。随着对家系其他成员追踪，更多证据支持该家系诊断应为MEN2A。表现为2 位甲状腺髓样癌先证者同时罹患原发性甲状旁腺功能亢进症，另1 例嗜铬细胞瘤先证者降钙素水平升高且携带RET原癌基因突变。

RET原癌基因的突变是MEN2A 发病的分子基础，迄今为止所发现的MEN2A 均由RET原癌基因突变引致。基本上所有的MEN2A 患者都会发生甲状腺髓样癌，嗜铬细胞瘤或甲状旁腺功能亢进症的外显率与RET突变的类型有关[1]。如RET基因11 号外显子密码子634 突变者嗜铬细胞瘤及甲状旁腺功能亢进症外显率较高，嗜铬细胞瘤的外显率随年龄增长而增加，30 岁时外显率25%，50 岁时外显率可达52%，77 岁时为88%，而甲状旁腺功能亢进症者外显率无明显年龄差异，不同报道中约为10%～30%[6-7]；而RET基因10 号外显子密码子突变者嗜铬细胞瘤（4%～26%）及甲状旁腺功能亢进症（2%～12%）外显率更低[8-9]。本组中RET618 密码子突变的1 例患者（7.7%）罹患嗜铬细胞瘤，2 例患者（15.4%）罹患甲状旁腺功能亢进症。临床工作中对甲状旁腺功能亢进症的筛查应与嗜铬细胞瘤的筛查同时进行。

RET基因突变类型对疾病的诊治及预后也起重要作用。95%的患者RET种系突变发生在外显子10 的密码子 609、611、618 或 620 或外显子 11 的密码子 634[10]。2015 年 ATA 及 2020 年 甲 状 腺 髓 样 癌 诊 断与治疗中国专家共识（2020 版）均指出MEN2A 需要检查的RET基因突变位点主要包括上述6 个位点[1-2]，若上述检查未发现明确的突变位点，或临床表型与检查结果不一致时，应进一步采用全RET基因编码区测序进行筛查。结合第七届国际MEN 协作组、北美神经内分泌肿瘤协会意见，2015 年ATA 指南修订了MEN 的危险分级，并对其随访及治疗提出建议，其中ATA“最高危组”包括M918T 密码子突变（MEN2B相关RET基因），“高危组”包括C634 密码子突变，“中危组”指除M918T 及C634 密码子突变外的其他RET基因突变。对于不同的危险等级给出相应的治疗建议：“最高危”突变类型患者建议1 岁内行甲状腺切除术，“高危”突变类型患者在5 岁内行预防性甲状腺切除，“中危”突变类型患者满5 岁后开始接受每半年或1 年的体格检查、血清降钙素及颈部超声的筛查，如果出现降钙素升高，则建议手术切除甲状腺。本组病例突变检测结果为第10 外显子Cys618Ser 属“中危”范畴，家族中最大年龄基因携带现存者已82岁，目前家系中所有基因携带者均出现不同程度的降钙素水平升高及甲状腺B 超的异常，但是出于各种原因，其他8 例携带者未选择手术，仍处于密切监测随访中。

本组中所有Cys618Ser 基因突变携带者均表现出降钙素水平的升高，而降钙素正常者无携带RET基因突变，体现了降钙素水平与RET基因突变之间的高度一致性。3 例Cys618Ser 基因突变携带家系成员仅表现表现为甲状腺滤泡囊肿，其年龄分布为7～33 岁，另 1 例RET基因突变携带者（Ⅳ-6）1 年前甲状腺B 超提示甲状腺弥漫性病变，后逐渐出现甲状腺小结节，降钙素水平也在逐渐升高（25.2 pg/mL 升至35.16 pg/mL）。据此推测，RET基因突变携带者在早期可能仅表现为甲状腺滤泡旁细胞的增生或者甲状腺囊肿，后期逐渐进展为实质性结节。而最终确诊为甲状腺髓样癌的先证者其结节在超声改变上多为实质性结节，部分形态与甲状腺腺瘤无明显差别，与既往文献中描述一致[11-12]，提示单纯依靠甲状腺超声诊断甲状腺髓样癌存在误诊风险[12]。建议有家族史的家系成员除了要进行甲状腺B 超的检查外，还需要注重降钙素水平的筛查。

综上，早期识别是及时诊治MEN2A 的关键，RET基因检测对MEN2A 诊断及预后评估具有重要作用，降钙素监测与RET基因表型间一致性较好。临床医生需提高对该病认识，尤其是注意家族史的仔细询问及相关疾病的早期识别，及时筛查RET基因，以期改善患者的长期预后。