免疫比浊法测定D-二聚体假阳性病例干扰分析

杨宏伟，樊一笋(上海交通大学医学院附属苏州九龙医院检验科，江苏苏州 215021)

D-二聚体是纤维蛋白在纤溶酶作用下水解后的产物，人体内存在纤维蛋白高凝状态或者继发性纤维蛋白溶解亢进都会引起D-二聚体升高，因此，D-二聚体指标对于诊断和治疗血栓疾病具有很好的临床价值[1-2]。目前检测D-二聚体方法大多为免疫法，具有检测方便、检测时间短等优点[3]。但在临床应用中，会出现D-二聚体检测结果与临床不相符，影响因素主要有自身免疫干扰和外界的干扰。目前针对免疫法报道较多的干扰物质有异嗜性抗体(heterophile antibody, HA)、类风湿因子(rheumatoid factor, RF)等[4]，但之前极少文献对于人群中出现的D-二聚体干扰情况进行一个长时段及大样本量的检测及分析，并由于主流试剂厂家大都通过阻断方案对标本进行了处理，无法系统评估当前人群的样本干扰分布状况[5]。基于此，上海交通大学医学院附属苏州九龙医院检验科和苏州希肯(SysCan)公司合作，通过定制无抗干扰能力的试剂进行长时段的足量样本筛选。在筛选收集出现干扰的人群及对应的信息后，探讨临床检验中此类现象的出现频率以及可能的原因。

1 材料和方法

1.1研究对象 收集上海交通大学医学院附属苏州九龙医院检验科2020年4月至2020年8月间住院患者凝血测试样本，排除近期进行免疫抗体治疗者。用0.109 mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝新鲜静脉血，3 000 r/min离心15 min。

1.2试剂和仪器 测试试剂：为不含阻断剂的D-二聚体检测试剂，为苏州希肯公司按照我科要求定制，参考区间0～0.5 mg/L(FEU)；正常试剂：含有阻断剂的D-二聚体检测市售试剂，参考区间0～0.5 mg/L(FEU)，购自苏州希肯公司；复测试剂：INNOVANCE-D-Dimer试剂盒(西门子公司)；N Latex RF Kit(免疫比浊法，西门子公司)。Ci-300血凝仪(苏州希肯公司)，CS5100血凝仪(日本Sysmex公司)，BN ProSpec特定蛋白分析仪(西门子公司)。

1.3方法

1.3.1D-二聚体检测及假阳性筛选 将凝血检测样本先用D-二聚体测试试剂和正常试剂在Ci-300血凝仪上用乳胶增强透射比浊法同时进行测试。当2种D-二聚体试剂定性结果不一致时，使用复核试剂在CS5100血凝仪上用乳胶增强透射比浊法对测试结果进行第三方复测，参考区间为0～0.55 mg/L(FEU)。对于测试试剂阳性，正常试剂和复测试剂均阴性的结果，认为是疑似假阳性。

由于干扰物质在稀释时对结果的影响通常不呈线性变化，因此，在验证疑似假阳性结果时将血浆4倍、8倍、16倍、32倍、64倍稀释后分别再次测试D-二聚体，在排除hook效应的情况下，如标本稀释前D-二聚体测试值和稀释后测试值基本保持一致，说明该标本不存在干扰现象，不含有对测试产生干扰的物质；如稀释后D-二聚体测试值相对稀释前测试值，随着稀释比例的增加呈明显的下降趋势，说明此样本为假阳性样本。

1.3.2RF测定 用免疫比浊法在BN ProSpec特定蛋白分析仪上检测，参考区间为<15.9 IU/mL。

1.4统计学分析 采用MedCal 15.8统计软件对数据进行分析。率的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同试剂检测D-二聚体结果 共测试患者样本6 436例，其中剔除135例重复样本后，共6 301例纳入研究。测试试剂检测出现阳性的样本为1 043例，阳性率为16.55%；正常试剂检测出现阳性的样本为99例，阳性率为1.57%，阳性率差异有统计学意义(χ2=13.618，P<0.001)。

测试试剂与正常试剂检测均阳性的为41例，测试试剂阳性、正常试剂阴性的为1 002例，测试试剂阴性、正常试剂阳性的为58例。1 002例测试试剂阳性、正常试剂阴性样本经过复测，发现其中有921例为阴性，作为疑似假阳性样本，对于疑似假阳性结果进行梯度稀释进一步复测，最终确定假阳性样本共59例(占0.94%)。

2.2假阳性样本不同试剂检测D-二聚体结果比较 59例患者样本中，复测试剂检测值范围为0.05～0.54 mg/L；测试试剂检测值范围为0.04～0.53 mg/L。测试试剂检测结果随稀释度增大而降低，说明样本明显存在干扰，为假阳性样本。见表1。

表1 希肯和西门子公司试剂D-二聚体检测不同稀释度检测结果[中位数(第25百分位数，第75百分位数)，mg/L]

2.3假阳性样本基线资料 59例假阳性样本中，男性25例，女性34例；40岁以下7例，40～60岁14例，38例为60岁以上；常见疾病类型：炎症30例(慢性肾炎8例，胃炎15例，过敏2例，急性胰腺炎3例，其他2例)，高血压24例。见表2。

表2 假阳性样本的基线资料(n=59)

3 讨论

目前市面上主要使用乳胶免疫增强比浊法在凝血分析仪上进行D-二聚体的测试[6-7]。作为均相免疫法的检测方案，较易出现由样本所造成的检测结果假阳性，这种假阳性是临床工作中所出现的一种重要的不可控因素[8]。出现假阳性样本可能原因是内源性干扰因素如自身抗体、HA、人抗动物抗体以及一些结合蛋白等[9]。在接触某些动物或使用了动物源性制剂后，动物源性蛋白进入人体，机体对动物蛋白引起免疫应答，形成人抗动物免疫球蛋白，有IgG、IgA、IgM和IgE几种类型[10]。不同制剂使用的动物源性不同，目前报道存在循环抗性的抗体，涉及到的动物广泛，比如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、牛等，不同动物免疫球蛋白分子间蛋白质序列有大量同源性，因此抗动物抗体可与多种动物免疫球蛋白交叉反应。当使用的制剂存在同源蛋白抗性时，存在的干扰效果很明显[11]。HA通常包含天然抗体和因接触未知动物而产生的自身抗体，同人抗动物抗体一样属于内源性抗体，两者具有同源性，不同在于HA无明确的免疫原性，能够与多个物种免疫球蛋白结合，即使在健康人群中约有3%～15%体内含有HA[12]。

本研究数据显示，发现假阳性的出现在男性与女性间并无显著差别。随着年龄的增长，干扰情况的发生率显著增高，确认的干扰样本中有64.4%的干扰病例出现在60岁以上的人群。可见近年来，临床检验中发现假阳性的标本情况逐年增多，和人口的老龄化这一因素密不可分。

对出现干扰的病人进行病症统计，发现炎症的占比最高，达到50.8%，说明持续性的慢性炎症尤其是消化道炎症，可能是造成一些HA或者自身抗体出现的主要诱因之一。在临床检验工作中，需要对无血栓指征的炎症病人标本所出现的高值D-二聚体结果或是其他的异常免疫学反应结果保持足够的警惕，充分考虑出现干扰的可能性。

文献报道，免疫测试过程中出现假阳性的主要影响因素为独特性抗体和自然产生或自身免疫源性的RF[13]，但本研究筛查结果显示，干扰样本中RF因子升高样本的占比反而不高，仅仅只有16.9%，同时假阳性样本中诊断疾病为类风湿关节炎的占比也相对较低。相比之下，占比较高的以炎症为指征的患者则可能说明临床检验中标本现阶段的干扰来源或许更多地来自HA、人抗动物抗体或者一些特定的结合蛋白。

为了尽可能排除内源性干扰的问题，各试剂生产厂商在试剂中会加入阻断剂。研究表明，西门子INNOVANCE D-Dimer试剂和D-Dimer PLUS试剂比较，不确定是否存在HA等的内源性因素影响时，随着RF水平越高，前者的干扰更明显[14]。其他干扰因素如脂血和交叉反应、基质效应以及设备的性能等都会引起结果的升高或者降低[15]。本次测试所使用的西门子和希肯生物的D-二聚体试剂也针对此类因素有对应的解决方案，提升设备性能及提高测试值的准确性。西门子试剂在RF值较高时，干扰排除不完全，但在样本进行4倍稀释后能完全阻断；希肯试剂对RF阻断较好，当存在其他干扰因素时，也存在不能完全阻断的情形，但样本进行4倍稀释后也能完全阻断。虽然2种试剂都出现了未能完全阻断的情形，但是从现有的阻断后结果来看，基本不影响临床的诊断。但若试剂无阻断效果或者阻断能力较弱，那么其检测结果则会给临床的诊断带来较大的困扰。

干扰因素所造成的假阳性结果会引起临床对疾病的误诊误判甚至错误的治疗，因此临床和实验室都必须对免疫中的干扰因素给予足够的重视。通过仔细阅读试剂厂家的说明书及和试剂厂家的积极沟通，明确试剂的抗干扰能力，同时在出现检验结果与临床征象不符时，临床医师与检验医师应该及时、充分、有效和持续的沟通；通过进行样本的多倍稀释方案以及病人的多种资料信息去积极分析干扰的可能因素，并采取适当方案重新检测，得出正确的结果。