过敏性疾病幼儿肠道菌群分析*

余夏，王晶，石明芳，赖春慧，梁秀云(南宁市第二人民医院医学检验科，南宁 530031)

近年来，婴幼儿过敏性疾病发生率大幅增加，此类疾病致病原因仍然不明，存在遗传因素和环境因素等说法[1]，常见的病症主要有食物过敏、特异性皮炎、哮喘等[2]。多项研究表明，生命早期过敏性疾病的发生与肠道菌群变化存在因果关系，过敏性疾病患儿的肠道微生物多样性较低，肠道菌群的紊乱先于过敏性疾病的发生[3]。与健康儿童相比，患过敏性疾病儿童肠道中益生菌如双歧杆菌、乳酸杆菌丰度较低，而拟杆菌科、梭状芽胞杆菌科、肠杆菌科等丰度升高[4]。在生命早期，婴幼儿肠道菌群逐步建立，与此同时肠道免疫系统逐步发育成熟，是形成免疫耐受的关键时期。如果这一时期肠道菌群发生紊乱，可推动免疫系统炎症反应，引起婴幼儿过敏性疾病。随着二代测序技术发展和人体肠道微生物基因图谱的绘制，本研究基于16S rRNA基因可变区V3-V4测序方法对肠道菌群进行鉴定，比较过敏性疾病幼儿的肠道菌群构成和正常幼儿的差别。如能在早期纠正肠道菌群紊乱，过敏性疾病提早得到干预，可抑制或减缓疾病进一步发展。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取2019年1月至2020年12月在南宁市第二人民医院就诊的10例过敏性疾病患儿为实验组(其中湿疹6例，过敏性皮炎3例，过敏性鼻炎1例)，6例正常幼儿为对照组。实验组纳入及排除标准：(1)年龄2～4岁，喂养方式大致相同；(2)临床诊断为湿疹、过敏性皮炎、过敏性鼻炎，诊断标准参考文献[4-5]；(3)入组前1个月未使用抗菌药物、益生菌、益生元等；(4)近1个月内未出现过腹泻(>3次/天)及其他肠道疾病；(5)无糖尿病、肥胖及其他代谢性疾病；(6)无感染性疾病。正常对照组纳入及排除标准：(1)进行常规体检的婴幼儿，未出现过食物过敏、特异性皮炎、哮喘、湿疹、鼻炎等症状；(2)年龄2～4岁，喂养方式大致相同；(3)入组前1个月未使用抗菌药物、益生菌、益生元等；(4)近1个月内未出现过腹泻(3次/天)及其他胃肠道疾病；(5)无糖尿病、肥胖及其他代谢性疾病；(6)无感染性疾病。本研究通过南宁市第二人民医院临床研究伦理委员会批准(编号Y201812)。

1.2标本采集 采集受试者新鲜成形粪便，取后段粪便的中间部分(体积约为25 mm×25 mm×25 mm)，放入无菌采集盒中，所有样本-80 ℃保存，后送至广西安仁欣医学检验实验室进行DNA提取、文库构建及测序。外周血采集：采集EDTA抗凝血2 mL用于血浆分离，保存于-80 ℃待检。

1.3仪器与试剂 T100梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)，Qubit@ 2.0 Fluorometer(美国Thermo Scientific公司)，Agilent Bioanalyzer 2100 system(美国Agilent 公司)，Illumina Hiseq测序平台(美国Illumina公司)。磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒(DP712)、Universal DNA纯化回收试剂盒(DP214)(北京天根公司)，16S rRNA扩增引物由上海生工生物公司合成，Phusion Master Mix (2×，美国Thermo Scientific公司)，TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(美国Illumina公司)，人白介素17A(IL-17A/IL-17) ELISA试剂盒、人白介素10(IL-10)ELISA试剂盒、人γ干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒(武汉华美公司)。

1.4DNA提取和PCR扩增、测序 粪便标本采用基因组提取试剂盒提取DNA，用341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)两对通用引物对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，在T100梯度PCR仪上进行。反应体系共30 μL，包括Phusion Master Mix(2×)15 μL，1 μmol/L正、反向引物各1 μL，模板DNA 10 μL(5～10 ng)，无核酸酶水补足至30 μL。扩增程序为：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物用18 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，从琼脂糖凝胶中提取PCR产物，Universal DNA纯化回收试剂盒进行纯化。文库构建按照TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit说明书进行操作。用18 g/L琼脂糖凝胶电泳分析后，回收600 bp片段进行纯化。产物检测采用Qubit@2.0 Fluorometer和Agilent Bioanalyzer 2100 system，后使用Hiseq测序平台进行Paired-End测序。

1.5生物信息学分析 序列拼接使用软件FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads， v1.2.11)利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列，得到高变区的Tags。如果下机数据带有特异片段扩增的引物，将使用软件CUTADAPT(v1.18)对Tags进行去引物处理。基于相似度大于97%操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)聚类，利用软件VSEARCH(v2.3.4)将拼接好的Clean Tags进行OTU聚类，然后通过对OTU注释完成OTU的物种分类。通过RDP classifer(v2.2)软件将OTU代表序列与数据库有比对进行物种注释，比对数据库Silva 128，基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。使用R(v3.5.1)软件绘制稀释曲线，Alpha多样性指数绘制盒形图。Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析，包括observed species指数、chao指数、ace指数、shannon指数以及simpson指数等[6]。主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)通过QIIME(v1.9.1)软件进行，R(v3.5.1)软件绘制二维图。使用LEfSe软件进行线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)。

1.6血浆细胞因子检测 用ELISA法测定血浆细胞因子IL-17、IL-10及IFN-γ的浓度。

1.7统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行。肠道菌群分析采用R(v3.5.1)语言中非参数检验Wilcoxon Rank-Sum Test进行实验组和对照组间的Alpha多样性指数差异分析。Beta多样性通过QIIME(v1.9.1)软件进行PCoA分析，使用weighted UniFrac距离矩阵反映两个群落之间差异性。细胞因子结果符合正态分布计量资料，用均数±标准差表示，采用两样本t检验比较组间差异；不符合正态分布的计量资料用中位数(第25百分位数，第75百分位数)表示，采用Mann-WhitneyU检验比较组间差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肠道菌群OTU统计和Alpha多样性分析 在97%的相似度下，得到每个样品的OTU个数，16个样本共产生919个OTU，其中实验组特有147个，对照组特有183个，2组共有589个，见图1。16个样本的Chao指数稀释曲线，均趋于平缓，测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种,见图2。实验组observed species指数小于正常对照组(266.20±72.60 vs 387.50±118.14，W=50，P=0.03)，实验组ace指数小于正常对照组(306.02±75.52 vs 439.65±125.73，W=50，P=0.03)，差异有统计学意义(P<0.05)。实验组chao、shannon指数高于对照组(W=48、40，P=0.06、0.31)，simpson指数低于对照组(W=23，P=0.49)，差异无统计学意义(P>0.05)。盒形图显示组间Alpha多样性差异，说明实验组的肠道微生物物种多样性低于健康对照组，见图3。

注：SD，实验组；Healthy，健康对照组。

注：SD1～SD10，实验组；H1～H6，对照组。

注：SD，实验组；Healthy，对照组。

2.2两组研究对象肠道菌群Beta多样性分析 使用PCoA的方法展示两组样品间的差异大小，主成分1的量为41.89%，主成分2的量18.77%，图4显示同组样本之间距离较近，物种组成较相似。样本之间无重叠，表明实验组和对照组样本肠道菌群组成有差异。

注：SD，实验组；Healthy，对照组。

2.3肠道菌群差异分析 用LEfSe 软件进行LDA分析找出组间在丰度上显著差异的物种。基于LDA score筛选的柱形图显示不同分组的物种丰度间的差异(图5)，每一个横向的柱形代表一个物种，柱体长度对应LDA score。实验组的优势物种为布劳特氏菌属(Blautia)和放线菌属(ActinomycesgraevenitziiF0530)；正常对照组的优势物种为紫单胞菌属(Parabacteroides)、类杆菌属(BacteroidesThetaiotaomicron)。

注：SD，实验组；Healthy，对照组。

2.4物种丰度分析 在门分类水平上，实验组与对照组的优势菌群分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)(图6A)。在属水平上，健康对照组的优势菌群为拟杆菌属(Bacteroides)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)，实验组的优势菌群为双歧杆菌属(Bifidobacterium)、埃希菌属(Escherichia-Shigella)、布劳特氏菌属(Blautia)和艾克曼菌属(Akkermansia) (图6B)。

注：SD，实验组；H，对照组；A，各组样本Phylum分类水平中物种profiling柱状图；B，各组样本Genus分类水平中物种profiling柱状图。

2.5细胞因子水平检测 实验组血浆中细胞因子IL-17、IL-10及IFN-γ的含量均高于对照组，两组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 实验组与对照组血浆细胞因子IL-17、IL-10及IFN-γ的含量(pg/mL)

3 讨论

人体肠道内微生物是人类细胞数量的10倍，其总重量超过1.5 kg，编码的基因数是自身基因组的100倍[7]，肠道微生物的基因集合被认为是人体的“第二套基因组”。生命早期微生物群落的发育成熟异常可能通过改变免疫系统的构建而导致疾病[8]。流行病学调査、临床研究、人体和动物实验表明，过敏性疾病患儿的肠道菌群构成和正常儿童有明显差异[9-11]，生命早期肠道菌群的紊乱先于过敏性疾病的发生。

本研究中，比较过敏性疾病幼儿与正常幼儿肠道菌群结构和多样性差异，探讨生命早期肠道微生物的变化与过敏性疾病发生的关系。影响婴幼儿肠道微生物的因素很多，抗菌药物的使用、饮食、使用益生菌、环境及遗传因素等。为了避免宿主本身和外界因素对结果的干扰，本研究过敏组和健康对照组幼儿年龄匹配，喂养方式大致相同，采样前1个月未使用抗菌药物、益生菌和发生肠道感染。Alpha多样性分析中的observed species指数、 chao指数、ace指数、shannon指数越大, simpson指数越小，说明样品中的物种越丰富。通过指数比较和盒形图显示，发生过敏性疾病幼儿肠道微生物物种多样性低于健康幼儿，这与Abrahamsson等[12]研究特异性皮炎患儿肠道菌群多样性结果一致。Chao指数稀释曲线显示菌群的测序量足够大，可进行进一步生物学分析。Beta多样性分析评估微生物群落间的差异来比较组内菌群的相似度[13]，PCoA图显示同组菌群大致聚类在一起，组间表现为较明显的分离,过敏婴幼儿与正常婴幼儿肠道菌群之间存在差异。LDA分析显示过敏婴幼儿肠道菌群丰度明显低于对照组，实验组的优势物种为布劳特氏菌属(Blautia)和放线菌属(ActinomycesgraevenitziiF0530)；正常对照组的优势物种为紫单胞菌属(Parabacteroides)、类杆菌属(BacteroidesThetaiotaomicron)。这种差异与文献报道中过敏患儿粪便中拟杆菌、变形菌、放线菌数量减少，厚壁菌数量增多相似[14]。

肠道菌群测定的序列数聚类成OUT，在不同分类等级上进行profiling，本研究中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)为主要的优势菌群，符合文献中婴幼儿肠道菌群在门水平上分布的结果[15]。在属水平上，对照组中拟杆菌属(Bacteroides)的表达高于过敏组，双歧杆菌属(Bifidobacterium)的表达低于过敏组，但具体差异需进一步统计分析。文献研究发现脆弱拟杆菌具有抗炎的作用[16]， 可通过分泌TGF-β修复肠上皮细胞，过敏患儿肠道拟杆菌属菌群表达下降，可能导致肠道黏膜免疫屏障的破坏，后续进展为过敏反应。而双歧杆菌为常见益生菌，由于其能产生分泌型IgA而对肠黏膜有保护作用，但在过敏组中表达升高，可能与慢性炎症反应中有黏膜修复作用有关。

过敏性疾病属于免疫反应作用下的慢性炎症，肠道菌群是肠道免疫发展的重要刺激因素。新生儿先天性免疫系统偏向于表现为TH2，正常情况下，出生后TH2反应和TH1反应逐渐达到平衡状态[17]。而婴儿肠道若处于微生态失调的状态，某些肠道菌群或致敏原的入侵，会导致多种免疫细胞的共同作用下TH2免疫应答增强[18]。相关免疫细胞如TH17 细胞能够分泌产生IL-17A、IL-6、TNF-α等促炎因子，诱导机体的炎症及自身免疫反应；而调节性T细胞(Treg)则在免疫反应中起到负反馈作用，通过分泌IL-10、TNF-β等细胞因子来调节免疫耐受；CD8+T细胞活化后则产生IFN-γ。本研究中过敏组幼儿血液中细胞因子因子IL-17、IL-10及IFN-γ的含量均高于正常对照组，符合这一说法。其他过敏性疾病研究中，特异性皮炎、食物过敏、哮喘患儿的细胞因子水平都有不同程度的变化[19]。这进一步说明生命早期肠道菌群的变化参与肠道免疫应答，改变了机体免疫状态，可以导致过敏性疾病发生。

本研究通过16S rRNA基因可变区V3-V4测序技术，发现过敏性幼儿与正常幼儿肠道菌群多样性和物种丰度比较存在差异，并对肠道菌群变化导致机体出现免疫反应的情况进行检测。本研究也存在一定的局限性，由于样本量较少，组间也有少量样品混杂，且机体免疫状态改变导致疾病发生的机制都需要扩大样本量进一步研究。