呼吸道标本中腿伤克斯特菌的鉴定、生物学特性及药物敏感性分析*

姜蕾，饶玉婷，葛茹，郭小兵(.濮阳市油田总医院医学检验科，河南濮阳 457000；.郑州大学第一附属医院医学检验科，郑州 45005)

腿伤克斯特菌为革兰阴性球杆菌，与产碱杆菌属、博德特菌属、无色杆菌属及Pigmentiphaga相近，同属于产碱菌科[1]。在人体感染中，腿伤克斯特菌是一种极其少见的病原体[2]，传统的生物化学方法和MicroScan WalkAway、Vitek 2、API 20 NE等自动细菌鉴定系统无法准确地鉴定出该菌[3]，因此，该菌可能存在漏检或错检的现象，使人们可能忽视了该菌的临床重要性。随着基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)及16S rDNA测序技术的推广与应用，截至目前，腿伤克斯特菌在各种临床标本中被发现，但在中国仅有1例相关报道[4]。多篇文献指出腿伤克斯特菌与疾病的发生有关[5-7]。现对其鉴定方法、生物学特性及药物敏感性进行分析，为腿伤克斯特菌的鉴定和临床用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2019年1月1日—2020年12月31日濮阳市油田总医院呼吸科和心脏内科的4位不同患者的合格痰标本。合格的标准为：痰涂片镜下革兰染色白细胞>25个/低倍视野，鳞状上皮细胞<10 个/低倍视野[8]。本实验室保存的大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌 ATCC 27853为药敏质控菌株。

1.2患者资料 患者1男性，68岁，呼吸一区，临床诊断：肺部感染；泌尿道感染；慢性阻塞性肺病伴有急性加重；气管切开术后拔管困难；缺血缺氧性脑病后遗症；陈旧性肋骨骨折；糖尿病；高血压。其痰培养同时检出肺炎克雷伯菌及腿伤克斯特菌。患者2男性，78岁，呼吸一区，临床诊断：肺部感染；脑出血术后；气管切开术后拔管困难；陈旧性脑梗死；下肢静脉血栓形成；高血压。其痰培养同时检出肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌及腿伤克斯特菌。患者3男性，78岁，呼吸二区，临床诊断：肺间质纤维化并感染；脑萎缩；混合性睡眠呼吸暂停综合征；阵发性心房颤动；冠心病；高血压；糖尿病。其痰培养同时检出铜绿假单胞菌及腿伤克斯特菌。患者4女性，71岁，心脏内科监护室，临床诊断：肺部感染；慢性肾衰竭；肾性贫血；冠心病；高血压；2型糖尿病伴多个并发症。其痰培养同时检出铜绿假单胞菌及腿伤克斯特菌。

1.3主要仪器与试剂 血平板、麦康凯平板、含万古霉素巧克力平板(郑州安图生物公司)；革兰染液(珠海贝索公司)；细菌微量生化反应管(杭州滨和微生物试剂公司)；MALDI-TOF MS仪及基质(德国Bruker公司)；甲酸、乙腈和三氟乙酸(美国Sigma公司)；Mastercy clerpro PCR 仪(德国Eppendorf公司)；2×Taq Master Mix(南京诺唯赞公司)；Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏系统、配套GN鉴定卡及GN-09药敏卡(法国生物梅里埃公司)。

1.4细菌培养 取患者痰标本涂布于血平板、麦康凯平板及含万古霉素巧克力平板上，分区划线，置 35 ℃培养 24～48 h。

1.5菌种鉴定

1.5.1Vitek 2 Compact鉴定 挑取3个以上单个纯菌落于3 mL 0.45% NaCl溶液中，调至菌悬液浓度为0.5麦氏浊度单位，插入GN卡上机经Vitek 2 Compact系统对细菌进行种类鉴定。

1.5.2MALDI-TOF MS鉴定 用无菌牙签挑取血平板上单个纯菌落均匀涂布于靶板的靶点上，室温干燥后，依次加1 μL 70%甲醛及1 μL基质溶液，室温下自然晾干后，将靶板放入MALDI-TOF MS仪器中进行分析。分析软件得出分值，依据说明书：>2.000，认为鉴定到种；1.700～1.999，认为鉴定到属；0～1.699，认为此鉴定结果不可靠。

1.5.316S rDNA测序 采用水煮法(100 ℃煮沸10 min，冷却至室温后，12 000 r/min离心10 min)提取细菌DNA。16S rDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[9]由上海生工生物公司合成。PCR反应体系为50 μL，包括2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 22 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 5 min。将PCR扩增产物送苏州金唯智生物科技有限公司，使用赛默飞ABI 3730系列高通量基因分析仪进行Sanger双向测序，测序结果上传至局部序列比对基本检索工具BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)中Nucleotide BLAST进行序列比对，确定细菌种类。

1.6革兰染色及生化反应 用接种环挑取血平板上单个菌落于载玻片上，待干燥固定后行革兰染色。过氧化氢酶试验：用接种环挑取细菌于载玻片上，滴1滴3%H2O2，出现大量气泡为阳性。氧化酶试验：用洁净滤纸蘸取少量细菌，滴加试剂1%盐酸二甲基对苯二胺，滤纸呈深紫色为阳性。其他试验在微量生化反应管中进行：分别挑取纯菌落至反应管中，置35 ℃温育24 h后，依据试剂说明书分别加入相应指示试剂后观察结果。

1.7药物敏感性试验 采用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定药敏系统及配套GN-09药敏卡进行药敏试验，结果依据2021年美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100其他非肠杆菌折点判读[10]。

2 结果

2.1菌落形态及镜下形态 35 ℃培养24 h 时，4株菌株在血平板、含万古霉素巧克力平板及麦康凯平板上均生长良好，血平板、巧克力平板上菌落呈灰白色，麦康凯平板上菌落呈浅紫色，菌落均表面粗糙、扁平且迁徙生长(图1、图2)。血平板、麦康凯平板上的菌落用棉拭子蘸取分别呈现黄色及紫色。镜下形态为单个、成对或短链状排列的革兰阴性球杆菌(图3)。

图1 血平板35 ℃培养24 h菌落形态

图2 麦康凯平板35 ℃培养24 h菌落形态

图3 革兰染色镜下形态(×1 000)

2.2菌种鉴定结果 4株菌株经Vitek 2 Compact鉴定均为放射型根瘤菌(Rzb.radiobacter)，可信度均为99%。MALDI-TOF MS鉴定结果均为腿伤克斯特菌(Kerstersiagyiorum)，鉴定分值分别为2.285、2.158、2.130和2.235。16S rDNA测序结果经BLAST序列比对显示为Kerstersiagyiorum(均>99%的覆盖度和>99%的一致性)。

2.3主要生化反应结果 4株菌株生化反应相同，均过氧化氢酶、动力试验阳性，氧化酶、硝酸盐还原、尿素酶、氨基酸脱羧酶(鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸)、靛基质、枸橼酸盐利用、糖(醇、苷)类发酵、β-半乳糖苷酶、七叶苷水解试验均阴性。

2.4药敏结果 1株菌株对环丙沙星中介，3株为耐药。2株菌株对左氧氟沙星敏感，1株中介，1株耐药。4株菌株对青霉素类、头孢类、酶抑制剂类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、磺胺类等常见抗菌药物均敏感。见表1。

表1 4株腿伤克斯特菌的药敏结果

3 讨论

2003年，Coenye等[1]从下肢伤口、痰和粪便等临床分泌物中首次发现了克斯特氏菌属，同时，因为该菌主要分离自下肢伤口，故将其命名为腿伤克斯特菌。腿伤克斯特菌镜下为革兰阴性球杆菌，其在血平板上菌落呈灰白色，麦康凯平板上菌落呈浅紫色，菌落均表面粗糙、扁平且迁徙生长，与文献[7]描述一致。该菌过氧化氢酶、动力试验阳性，氧化酶、硝酸盐还原、尿素酶、氨基酸脱羧酶、靛基质、枸橼酸盐利用、糖(醇、苷)类发酵、β-半乳糖苷酶及七叶苷水解试验阴性，在日常工作中依据其菌落形态及氧化酶阴性可初步鉴别。

由于腿伤克斯特菌与产碱杆菌科其他菌属的生物特性相似，因此生物化学方法不易区分[11]。同时，MicroScan WalkAway、Vitek 2和API 20 NE等自动细菌鉴定系统也无法准确地鉴定该菌，但文献和本研究中，MALDI-TOF MS及测序技术均能准确鉴定出该菌属，有助于少见病原体的检出[3]。随着临床实验室中MALDI-TOF MS的普及，腿伤克斯特菌被发现在各种临床标本中，如血液[6]、支气管肺泡灌洗液[12]、尿液[13]、耳脓性分泌物[14]、下肢伤口分泌物[2]等，但在中国仅有1例相关报道[4]，可能与人员认识能力、实验室条件等密切相关。

在本研究中，2名患者痰培养均分离出铜绿假单胞菌与腿伤克斯特菌，1名患者分离出肺炎克雷伯菌与腿伤克斯特菌，另一名患者分离出肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌与腿伤克斯特菌，提示腿伤克斯特菌感染的患者常呈混合感染，这与Ogawa等[13]发现相似，究其原因，可能该菌更易在有利于混合感染的条件下生长。同时，据报道，在免疫抑制患者中，常检出无色杆菌属和产碱杆菌属(与该菌相似)与其他细菌混合感染[13,15]。因为此细菌常呈混合感染的特性，该菌在疾病的进展过程中发挥的作用还不清楚，但在Bostwick等[6]研究中，患者严重的疾病、血培养单菌的检出及依据药敏结果应用抗菌药物治疗后的临床改善均提示腿伤克斯特菌是导致其疾病的主要原因。

药敏结果显示，4株腿伤克斯特菌对氟喹诺酮类抗菌药物敏感、中介或耐药，对其他常用抗菌药物均敏感，这与Deutscher等[12]报道的基本一致，与Bostwick等[6]报道不同，可能与地域性、个体性差异等有关。微生物室应及时对分离菌进行体外药物敏感性试验以指导临床合理用药。同时文献报道腿伤克斯特菌SWMUKG01 含有氟喹诺酮、磺胺、利福平和磷霉素等耐药基因以及外排泵系统[4]，提示某些腿伤克斯特菌可能为多重耐药菌，应引起临床重视。

综上所述，腿伤克斯特菌可能与某些疾病的感染相关。作为微生物检验人员，应增强对此菌的认知，若多次在合格标本中检出该菌且镜下有白细胞吞噬现象，应高度怀疑与感染相关。同时，微生物学实验室应多借助MALDI-TOF MS及16S rDNA测序技术提高少见病原体的检出率。