黄皮西葫芦类胡萝卜素合成酶基因的鉴定及PSY1和LCYE2克隆分析

唐忠丽，逯晓楠，赵 蕊，刘庆华，李梅兰，雷逢进，许小勇

(1.山西农业大学 园艺学院，山西省设施蔬菜协同创新中心，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 棉花研究所，山西 运城 044000)

西葫芦(CucurbitapepoL.)别名美洲南瓜，原产北美洲南部，属于葫芦科南瓜属作物，其既可以采摘嫩瓜当作蔬菜食用，又可以采收老瓜用作打籽，在我国南北方广泛种植。西葫芦营养丰富，有黄色、绿色、白色、黑绿等多种颜色类型，还具有较高的观赏价值。色素含量测定结果表明，其主要是由类胡萝卜素和叶绿素等色素的多样性积累导致[1]。

类胡萝卜素是自然界中分布最为广泛的一大类色素，不仅赋予植物花、果实等器官鲜艳的色彩，还在光合作用、ABA和芳香物质合成中起重要作用[2]。目前，植物类胡萝卜素合成代谢途径已基本清晰，共涉及八氢番茄红素合成酶(Phytoene Synthase，PSY)、八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene Desaturase，PDS)、番茄红素环化酶(Lycopene Cyclase，LCY)等11种合成代谢酶[3]。这些结构基因的序列变异或者转录水平会直接导致园艺作物中类胡萝卜素含量改变。例如，Gady等[4]研究发现，番茄中PSY1基因单氨基酸位点变化，导致番茄红素和β-胡萝卜素合成缓慢。洪敏等[5]克隆了枇杷中的PSY基因，表明PSY基因可能参与其类胡萝卜素的合成调控。程洁等[6]从甘薯中克隆到PSY基因，在拟南芥中超表达PSY基因后，叶片中的类胡萝卜素含量明显提高。李永平等[7-8]从黄秋葵中克隆到PSY和LCYB基因，揭示了PSY和LCYB基因表达和类胡萝卜素积累的特性。Pogson等[9]研究发现，拟南芥中编码LCYE基因LUT2，其lut2突变体表现为叶黄素缺失型，同时β-胡萝卜素含量大量积累。韩璇等[10]从矮牵牛中克隆到PhLcyB基因，发现其对矮牵牛叶片中类胡萝卜素的代谢调节有重要作用。此外，一些转录因子如MYB、bHLH、ARF以及APRR2、Or等基因，也可以通过调控类胡萝卜素代谢相关基因的转录水平，间接影响类胡萝卜素的积累[11-14]。总而言之，植物体内主要是通过直接或间接调控类胡萝卜素合成代谢相关酶基因的表达，从而影响类胡萝卜素的积累，最终使植物呈现不同色泽。

瓜类类胡萝卜素积累相关基因克隆研究已取得一定的进展。吕品等[15]从西瓜果实中克隆到ClPSY基因，推测ClPSY基因主要负责果实中类胡萝卜素的合成。吴川等[16]也从红肉西瓜中克隆到ClZDS基因。赵军林等[17]在甜瓜中克隆到八氢番茄红素脱氢酶CmPDS基因，且发现CmPDS基因随果实的发育成熟，表达量呈现先升后降的趋势。尽管如此，但仍有大量类胡萝卜素合成代谢相关基因未被克隆报道，尤其是关于西葫芦果皮颜色积累的分子机制、黄皮决定基因等依然未知。

本研究通过对类胡萝卜素合成代谢酶基因家族的鉴定、基因表达定量分析等，筛选并克隆西葫芦类胡萝卜素合成代谢相关酶基因，比较其序列差异等，旨在为下一步揭示黄皮西葫芦色素形成的分子机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用白皮、黄皮西葫芦材料均为高代自交系，于2020年春种植于山西农业大学园艺试验站大棚内，于结果期分别选取2种材料授粉后0，2，6，10，20 d的果实果皮，迅速放于液氮中冷冻，于-80 ℃冰箱备用。

1.2 西葫芦类胡萝卜素合成代谢相关酶基因的鉴定及表达分析

在葫芦科基因组数据库GuGenDB中(http：//cucurbitgenomics.org/)[18]下载已经注释的西葫芦类胡萝卜素合成代谢相关基因序列信息，进一步使用pfam数据库(http：//pfam.xfam.org/)[19]进行结构域筛选确认。利用公开发表的Sweet REBA和Lady Godiva这2种不同颜色果皮材料不同发育时期果实果肉的转录组数据[20]，分析类胡萝卜素合成基因在不同发育时期果肉中的动态表达。根据基因表达量FPKM值[21]来呈现基因表达水平，并利用TBtools软件[22]绘制基因表达热图。

1.3 qRT-PCR验证

样品总RNA的提取使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根，DP419)，使用2 × inNova Taq SYBR®Green qPCR Mix(With ROX)试剂盒(innovagene，SQ121-01)进行PSY1和LCYE2基因qRT-PCR定量分析。试验参照西葫芦基因组序列(http：//cucurbitgenomics.org/)，利用NCBI网站上的Primer-BLAST工具设计PSY1和LCYE2基因特异性定量引物(表1)。以西葫芦肌动蛋白Actin基因(GenBank登录号MH211008)用作内参基因，使用2-ΔΔCt法对试验结果进行归一化数据处理，统计相对表达量。

表1 引物名称及其序列Tab.1 Primer name and sequence

1.4 基因克隆及序列分析

样品总RNA的提取使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根，DP419)，cDNA的合成使用1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(innovagene，AR111-02)，具体操作步骤根据说明书进行。以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的片段(引物序列见表1)，并连接到pMD18-T载体上，挑取单菌落筛选、鉴定，并送至上海生工生物有限公司测序。利用SnapGene进行基因序列比对分析。

1.5 系统发育树分析

利用MEGA 7.0[23]软件中的邻接法(Neighbor-Joining methed，NJ)构建系统发育树，其中，校验参数Bootstrap值设置为1 000次，遗传距离计算模型设置为P-distance，空位缺失数据的处理设置为Pairwise deletion。

2 结果与分析

2.1 类胡萝卜素代谢酶基因的鉴定

通过对西葫芦数据库比对及pfam结构域筛选，最终在西葫芦基因组中共鉴定出48个类胡萝卜素代谢酶基因，每类酶基因平均有3.46个拷贝。其中，NCED基因8个，ZEP基因6个，GGPPS、PSY和CCD基因各5个，LCYB、BCH和ECH基因各3个，PDS、CRTISO、LCYE以及VDE基因各2个，ZDS和NXS基因均只有1个(表2)。这48个基因中，除ZEP1和LCYB3基因仅能定位于未组装的LG00染色体外，其余46个基因均分布在除了LG17和LG18之外的18条染色体上。大多数基因存在于基因密度较高的区域，其中，LG01和LG14染色体上基因数目最多，分别有6个；而LG02、LG06、LG08、LG09和LG20染色体上基因数目最少，分别只有1个。这些基因CDS的平均长度为1 395.75 bp，其中最长的是位于Cp4.1LG05染色体上的ZEP4(Cp4.1LG05g11360.1)，全长1 944 bp；而最短的是位于Cp4.1LG03上的NXS(Cp4.1LG03g06210.1)，全长693 bp。

表2 西葫芦类胡萝卜素代谢关键基因参考信息Tab.2 The information of key genes for carotenoid metabolism in zucchini

表2(续)

2.2 不同发育时期类胡萝卜素代谢基因表达模式分析

利用公开发表的Sweet REBA和Lady Godiva这2个材料不同发育时期果肉转录组数据，分析上述48个类胡萝卜素代谢基因表达模式，结果表明(图1)，GGPPS1、PDS、PSY2、LCYB2、LCYE2、BCH3、ECH3等基因在果实发育时期持续高水平表达，大多数CCD和NCED等基因在整个时期保持较低的表达水平；而PSY1、LCYE2等基因在2个材料间的表达水平动态变化差异相对较大，可能是由于2个材料中类胡萝卜素含量差异较大，在果实类胡萝卜素积累过程中起着关键性作用，是重点关注的对象。

R/LG表示2个西葫芦材料Sweet REBA/Lady Godiva；5/10/15/20/40分别表示授粉后5，10，15，20，40 d的果实。R/LG represents two zucchini materials Sweet REBA/Lady Godiva；5/10/15/20/40 respectively represent the fruits at 5，10，15，20，40 d after pollination.

2.3 候选基因PSY1和LCYE2的qRT-PCR分析

进一步对PSY1(Cp4.1LG13g05570.1)、LCYE2(Cp4.1LG11g11790.1)2个关键酶基因在白皮和黄皮西葫芦果皮不同发育时期的qRT-PCR分析表明(图2)，PSY1基因随着授粉后果实发育在白皮西葫芦中的表达水平总体呈逐渐降低趋势，而在黄皮西葫芦中总体呈现波动式上升趋势，尤其是在10 d表达量差异达到最大值，约为白皮西葫芦同期的10倍(图2-A)。LCYE2基因在白皮西葫芦中的表达水平一直处于相对较低水平，且逐渐降低，而在黄皮西葫芦中的表达水平逐渐升高，且在6 d及以后差异不断放大，远高于白皮西葫芦，在20 d时黄皮西葫芦中的LCYE2基因表达量已达到白皮西葫芦的40倍(图2-B)。由此可见，随着果实发育除PSY1基因0 d和LCYE2基因2 d外，其他时间点基因的表达水平都呈现出黄皮西葫芦高于白皮西葫芦的趋势。这2个基因在整个果实发育时期，尤其在10 d后的果实显著转色时期起着决定性作用。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different lowercase indicate significant difference(P<0.05).

2.4PSY1和LCYE2基因的克隆及序列分析

分别提取白皮、黄皮西葫芦的总RNA，合成cDNA一链，并以此为模板，扩增西葫芦的PSY1、LCYE2基因，分别得到约1 200 bp(图3-A)和1 800 bp(图3-B)的条带，与预期结果基本一致。随后的克隆测序结果发现，西葫芦PSY1、LCYE2基因分别编码1 263，1 602 bp的开放阅读框。与已公布的西葫芦基因组PSY1基因由6个外显子和5个内含子组成不一致的是，所克隆的白皮西葫芦PSY1(W)和黄皮西葫芦PSY1(Y)基因编码区序列比参考序列(1 212 bp)多出的51 bp是原本注释为内含子的一段片段(图4-A)。与GenBank已报道的(登录号：XM_023695146.1)序列一致，编码一个完整的蛋白质，比预测蛋白质序列多出17个氨基酸，不改变其余部分蛋白质编码序列。将西葫芦PSY1基因与其他瓜类的PSY1同源基因序列进行比对，结果显示，同源性高达96%，且在其他瓜类的PSY1基因中发现均含有51 bp的外显子区域(图4-B)。

PSY1(W)来自白皮西葫芦克隆，PSY1(Y)来自黄皮西葫芦克隆； LCYE2(W)来自白皮西葫芦克隆，LCYE2(Y)来自黄皮西葫芦克隆。M.DNA Marker DL2000。PSY1 (W)is cloned from white peeled zucchini， PSY1 (Y)is cloned from yellow peeled zucchini；LCYE2(W)is cloned from white peeled zucchini，LCYE2(Y)is cloned from yellow peeled zucchini.M.DNA Marker DL2000.

A.序列比对，Ref PSY1为参考序列，PSY1(W)为白皮西葫芦PSY1，PSY1(Y)为黄皮西葫芦PSY1；B.不同瓜类PSY1基因序列比对。A.Sequence alignment，Ref PSY1 is the reference sequence，PSY1 (W)is white peeled zucchini PSY1， PSY1 (Y)is yellow peeled zucchini PSY1；B.Sequence alignment of PSY1 gene in different cucurbits.

2.5 系统进化树构建

进一步应用MEGA 7.0软件构建PSY1基因与其他物种的PSY蛋白之间的系统进化树，结果表明(图5)，西葫芦与中国南瓜的亲缘关系最近，相似度高达98.80%。另一个LCYE2基因由11个外显子和10个内含子组成，外显子大小为103～300 bp不等，测序结果与基因组序列结构一致，无点突变和氨基酸差异。

图5 西葫芦PSY1基因与其植物PSY基因的系统进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PSY1 gene in zucchini and PSY genes in other plants

3 结论与讨论

果皮颜色是西葫芦重要的农艺性状之一，其类胡萝卜素含量与西葫芦的皮色密切相关。而PSY和LYCE基因是类胡萝卜素合成代谢的关键酶基因之一。郭新伦[24]研究发现，PSY基因在牛奶子(ElaeagnusumbellateThunb.)果实成熟期间表达量持续升高，除番茄红素外的其他类胡萝卜素含量逐渐下降或消失，说明牛奶子果实中番茄红素的积累是类胡萝卜素代谢途径各基因协同作用的结果。Guo等[25]研究发现，红肉西瓜中PSY1的表达与番茄红素积累呈正相关。Obrero等[26]对白皮、绿皮和黄皮西葫芦栽培品种比较观测发现，果皮和果肉颜色都与类胡萝卜素积累相关，PSY基因在橙黄皮西葫芦中表达量高于白皮和绿皮西葫芦；通过qRT-PCR确定番茄红素ε环化酶LCYe基因的转录水平与果皮果肉中类胡萝卜素的积累高度相关，且LCYE基因在橙黄皮和绿皮西葫芦中表达量高于白皮西葫芦，而在白皮西葫芦中几乎不表达。李静文等[27]研究发现，在芹菜中AgLCYE基因的表达量随着生长期的增加逐渐升高，叶柄中逐渐降低。余磊等[28]从三红蜜柚中克隆到PSY、PDS、ZDS、LCYB基因，发现这些基因在果实生长发育过程中呈现增长或先增后降的趋势，且在成熟期表达量最高。与Obrero等[26]的研究结果基本一致，本研究发现，PSY1基因在白皮西葫芦中的表达量逐渐降低，而黄皮西葫芦中的表达量呈现波动式上升趋势，在授粉10 d时表达量最高，且黄皮西葫芦中的表达量高于白皮西葫芦同期。LCYE2基因在白皮西葫芦中的表达一直处于较低水平且逐渐降低，而在黄皮西葫芦中随着果实发育逐渐升高，预示着PSY1和LCYE2基因在黄皮西葫芦色素积累过程中起着重要作用。

已经公开的基因组序列为研究者进行基因定位、克隆等提供了很多便利，但所预测序列可能有所偏差。本研究发现，从2种不同果色西葫芦中克隆到的PSY1基因均与已经报道GenBank(登录号：XM_023695146.1)预测序列基本一致，但比参考基因组预测的CDS序列多了一个51 bp的外显子。扩大比对群体，将西葫芦的PSY1基因与其他瓜类同源基因进行比对发现，其余瓜类也都含有51 bp的外显子区域，因此，西葫芦数据库中所预测的PSY1基因将这51 bp视为含子而忽略。因此，有时候生物信息学预测的CDS序列仍需要通过实际试验来验证。

综上所述，本研究从西葫芦参考基因组中鉴定了48个类胡萝卜素合成代谢相关酶基因，进一步通过表达定量等筛选并克隆出PSY1、LCYE2等2个关键基因，下一步将进行遗传转化等研究揭示基因功能，为后期进行黄皮西葫芦类胡萝卜素积累的分子机制的解析奠定基础。